黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區不同森林類型土壤微生物功能多樣性分析

程智超， 楊立賓， 隋 心*， 張 童， 王文浩， 尹偉平， 李國富， 宋福強

1.黑龍江大學生命科學學院, 黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150080

2.黑龍江省科學院自然與生態研究所, 黑龍江 哈爾濱 150040

3.黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區服務中心, 黑龍江 嫩江 161400

在生態系統中，土壤微生物不僅參與養分循環和代謝過程[1]，而且直接影響地球生物化學循環[2]，在植物凋落物的分解中起著重要作用[3]，并通過改善土壤中的微生物含量間接影響植被的生長[4]. 地質條件及植被等多種因素又對土壤微生物活性和多樣性特征具有反饋作用[5-6]，隨著植被組成的變化，土壤微生物生物量、活性、群落結構以及多樣性均呈現明顯變化[7-10]. 土壤微生物是森林生態系統重要的組成部分，在植被更新和演替過程中的作用尤其明顯. 土壤微生物群落和功能的改變會影響地上植物組成和多樣性. 因此，研究植被組成變化與土壤微生物結構和功能的變化是目前生態學的研究熱點，也是探究生態系統機制的重點研究領域.

森林生態系統是陸地生態系統的重要組成部分，在涵養水源、保育土壤、生態系統碳循環等方面具有重要作用[11]. 森林土壤不但是動植物分解和循環的場所[12]，而且還是林木生存的物質基礎[13]. 植物對土壤環境的重要影響之一是改變土壤微生物群落特征[14]. 例如，孫雪等[15]對原始紅松林退化演替后不同森林類型土壤微生物功能多樣性的分析發現，處于不同森林植被演替階段的土壤微生物碳源利用強度差異顯著. 而且，逄好勝等[16]對大興安嶺森林退化后不同植被類型土壤微生物功能多樣性的研究發現，3種植被退化類型的土壤微生物利用碳源存在較大差異. 由此可以預見，原始森林發生退化后，不同森林類型階段土壤微生物功能會發生明顯改變. 但是到目前為止，關于大小興安嶺交錯區不同森林類型的土壤微生物功能多樣性的變化尚不清楚.

黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區地處大小興安嶺過渡區，其森林類型具有大興安嶺和小興安嶺植被的特征. 但是由于人類活動的影響，以興安落葉松為建群種的原始林受到了大規模破壞，原始興安落葉松林面積減少，隨之而來的是次生演替以后出現的大量白樺林和蒙古櫟林. 森林類型的改變尤其是其建群種的改變會導致生態系統功能發生變化，土壤生態系統受到地上植被組成的影響更為顯著，但遺憾的是，目前關于植被變化或者說植被長期演替以后，土壤生態系統功能在森林交錯區的研究還很少，對于森林交錯區土壤微生物功能的特征還缺乏深入研究. 鑒于此，該研究利用Biolog-Eco微平板技術，對黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區3種典型的森林類型(興安落葉松林、白樺林、蒙古櫟林)土壤微生物功能多樣性的變化規律進行研究，旨在探討寒溫帶森林生態系統發生次生演替后土壤微生物群落功能的差異和變化規律，以期為深入了解我國寒溫帶森林交錯區森林生態系統功能和未來發展趨勢提供依據和數據基礎.

1 材料與方法

1.1 研究區域

試驗地點位于黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區(126°00′E～126°45′E、48°30′N～48°50′N)，該保護區位于黑龍江省黑河市西南部，地處小興安嶺西南山麓與松嫩平原的過渡地帶，總面積988.6 km2. 屬溫帶大陸性季風氣候區，冬季嚴寒漫長，夏季涼爽短促；年均氣溫-0.5 ℃，無霜期為121 d，年均降雨量476.33 mm，多年平均相對濕度69.2%. 不同森林類型呈隨機性分布，受周邊環境影響，處于不同演替階段的植物群落均有分布，保護區是典型的高寒森林生態系統，區內有森林、灌叢、濕地和草甸. 森林類型有針葉林、針闊混交林及闊葉林，保護區森林覆蓋率高達82.4%[17]. 主要植物有興安落葉松(Larixgmelinii)、紫椴(Tiliaamurensis)、鉆天柳(Choseniaarbutifolia)、白樺(Betulaplatyphylla)、黑樺(BetuladahuricaPall.)、蒙古櫟(Quercusmongolica)、山楊(Populusdavidiana)、稠李(Prunuspadus)、大黃柳(Salixraddeana)、東北赤楊(Alnusmandshurica)等.

1.2 研究方法

1.2.1樣地設置和樣品采集

于2019年7月進行樣品采集，在保護區內選取白樺林、蒙古櫟林、興安落葉松林3種典型的森林類型，每種森林類型內設置3塊樣地，每個樣地面積約400 m2，每個樣地內分別再設置3個10 m×10 m的小樣方.

采用五點采樣法采集表層(0～20 cm)土壤，混合為1個土樣. 采集后的土壤樣品首先剔除植物凋落物，然后過口徑為2 mm的土壤篩后放入自封袋中，置于4 ℃保溫箱中保存，帶回實驗室. 在實驗室內將土壤樣品分成2份，一份用于Biolog-Eco分析，一份室溫風干后用于土壤理化性質測定.

1.2.2土壤理化因子測定

土壤pH采用水浸提電位法(水土比2.5∶1)測定；w(SOC)和w(TN)采用元素分析儀(Elementar, Vario MAX CN, Germany)測定.

1.2.3土壤微生物群落功能多樣性的測定

首先將土壤樣品在25 ℃的恒溫箱活化24 h，然后稱取10.0 g鮮土加入到無菌的200 mL三角瓶中，再向三角瓶中加入100 mL 0.85%無菌氯化鈉溶液，用密封袋封口，室溫條件下，180 r/min振蕩30 min，靜置2 min后依次稀釋至10 mL和1 mL土壤懸浮液. 用移液器吸取150 μL土壤懸浮液于Biolog-Eco板中，25 ℃下培養，每組試驗均3次重復，590 nm處測定吸光度，每隔24 h測定1次吸光度，連續測定10 d[18-20].

1.3 數據分析

平均顏色變化率(average well color development, AWCD)計算公式：

(1)

式中，Ci為有碳源孔的吸光度值，R為對照孔的吸光度值，Ci-R≤0的孔在計算中記為0[21].

將培養216 h的數據用于計算土壤微生物群落功能多樣性，計算公式：

Shannon-Wiener多樣性指數[21]：

H=Pi×lnPi

(2)

Simpson優勢度指數[21]：

(3)

McIntosh多樣性指數[22]：

(4)

式中，Pi為第i個孔的相對吸光度值與所有孔相對吸光度值總和的比值,ni為第i孔的相對吸光度值[23].

數據分析采用Excel 2003和SPSS 17.0進行，采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，檢測水平選擇0.05水平，采用R語言進行熱圖、主成分分析(PCA)和典型相關分析(CCA)，數據包采用Vegan軟件包.

2 結果與討論

2.1 土壤理化性質

如表1所示，3種森林類型土壤pH、w(SOC)、w(TN)之間差異顯著(P<0.05). 其中，白樺林土壤pH最高，為6.03，落葉松最低，為4.39；白樺林的w(SOC)最高，為114.11 g/kg，落葉松林最小，為95.04 g/kg；白樺林w(TN)最高，為6.21 g/kg，而落葉松林最小，為4.69 g/kg；落葉松的C/N最高，為20.25，而白樺林C/N最小，為18.37.

表1 土壤理化性質

圖1 3種森林類型土壤微生物AWCD值的變化

2.2 土壤微生物AWCD的差異

AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的重要指標，反映了土壤微生物活性和功能多樣性[24-25]. AWCD值越大，表明土壤微生物的密度和活性越高；AWCD值越小，微生物密度和活性越低. 如圖1所示，3種森林類型土壤微生物AWCD值的變化規律隨著培養時間的延長而增加. 培養24 h后，土壤微生物適應了Biolog-Eco微孔板的基質環境，所有土壤微生物的AWCD值都急劇增加，表明所有土壤微生物群落都能夠在Biolog-Eco微孔板中代謝有機底物. 在24～216 h的培養期間，AWCD值增速更快，并且在216 h后趨于穩定，表明所有可培養的微生物都可以在穩定時期內穩定地使用碳源[26].

在3種森林類型土壤中，闊葉林(白樺林和蒙古櫟林)土壤微生物的AWCD值均高于針葉林(興安落葉松林). 216 h后，白樺林和蒙古櫟林土壤微生物的AWCD值分別從0增至0.8和0.7，而落葉松林的AWCD值增至0.6左右，表明闊葉林土壤微生物中活性較高. 然而，當落葉松林AWCD值趨于穩定時，其AWCD值增至0.6左右，說明落葉松林的土壤微生物活性最低. 綜上，不同森林類型下，土壤微生物的AWCD值不同，土壤微生物群落對碳源的利用能力大小表現為白樺林>蒙古櫟林>落葉松林.

2.3 土壤微生物代謝多樣性

從表2可以看出，3種森林類型土壤微生物的Shannon-Wiener指數和McIntosh指數差異顯著(P<0.05)，但是Simpson指數差異不顯著(P>0.05)，Shannon-Wiener指數呈白樺林>蒙古櫟林>落葉松林的規律，白樺林的Shannon-Wiener指數最高，為3.05；McIntosh指數呈蒙古櫟林>白樺林>落葉松林的規律，蒙古櫟林的Mclntosh指數最高，為9.28.

表2 土壤微生物碳代謝功能多樣性

2.4 土壤微生物利用不同底物的能力

根據碳源生理生化特征，Biolog-Eco的31個碳基質可以分為6類——糖類、氨基酸、酯、醇、胺和酸[27](見表3). 如圖2所示：代謝指紋圖譜中AWCD>2.0的碳源在白樺林土壤中有7種，包括i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、肝糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-蘇氨酸、吐溫40，其中i-赤蘚糖醇的AWCD值最高，為 2.776 0；蒙古櫟林土壤中有5種，包括L-天門冬酰胺、吐溫40、L-絲氨酸、D-甘露醇、吐溫80，其中L-天門冬酰胺的AWCD值最高，為 3.050 8；落葉松林土壤中有6種，包括D-甘露醇、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-D-乳糖、吐溫40、N-乙酰-D-葡萄糖胺、苯乙胺，其中D-甘露醇的AWCD值最高，為 2.832 4.

由圖3可見，該研究中土壤微生物群落代謝活性的熱圖結果可以分為4類：在Ⅰ類群中，落葉松林中2-羥基苯甲酸、D,L-α-磷酸甘油的AWCD值高于白樺林和蒙古櫟林；在Ⅱ類群中，白樺林中D-甘露醇、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺的AWCD值顯著高于落葉松林和蒙古櫟林；在Ⅲ類群中，落葉松林中D-木糖、α-D-乳糖的AWCD值顯著高于白樺林和蒙古櫟林；在Ⅳ類群中，蒙古櫟林肝糖、i-赤蘚糖醇的AWCD值顯著小于白樺林和落葉松林. 這表明不同森林類型土壤微生物的活性和碳源利用偏好有著顯著的不同.

2.5 土壤微生物群落的主成分分析

將不同樣本的多元向量通過主成分分析(principal component analysis，PCA)轉換為互不相關的主成分，可以利用點的位置形象直觀地在降維后的主元向量空間中反映出不同微生物群落對碳源的代謝特點，可以客觀準確地解釋微生物對碳源利用的多樣性[28]. 主成分的荷載值越高，意味著碳源對主成分的影響越大. 如表3所示，構成第一主成分(PCA1)的碳源有20種，包括4種糖類、6種氨基酸類、3種酯類、3種醇類、3種胺類、5種酸類，其中L-苯基丙氨酸是與PCA1(荷載值為0.996，見表3)最相關的碳源. 因此，L-苯基丙氨酸對PCA1產生了主要影響. 此外，構成第二主成分(PCA2)的碳源有9種，包括4種糖類、1種氨基酸類、1種酯類和3種酸類，其中D-木糖是與PCA2(荷載值為0.994，見表3)最相關的碳源. 因此，L-苯基丙氨酸和D-木糖是對土壤微生物碳代謝活性具有重要影響. 主成分分析結果表明，PC1和PC2的方差貢獻率分別為38.81%和30.30%(見圖4). 整體來看，白樺林、蒙古櫟林和落葉松林的土壤微生物群落功能存在顯著差異(見圖4).

2.6 土壤微生物碳源利用模式的差異及其影響因素

通過典型相關性分析對影響土壤微生物群落活性與森林土壤功能多樣性的環境因素進行研究. 結果(見圖5)顯示，前兩個CCA軸分別解釋了方差的35.67%和22.48%，第一CCA軸與土壤pH呈極顯著正相關(r=0.972 3)，第二個CCA軸與w(SOC)(r=0.792 8)、w(TN)(r=0.799 8)均呈顯著正相關. 總體來看，3種森林類型土壤微生物群落功能主要受到土壤pH、w(SOC)和w(TN)的影響.

土壤微生物功能多樣性指數與土壤理化性質之間的關系如表4所示. 從表4可以看出，對于土壤理化性質，AWCD值與pH(r=-0.787，P<0.05)呈顯著負相關；Shannon-Wiener指數與w(SOC)(r=0.773，P<0.05)呈顯著相關，與w(TN)(r=0.880，P<0.01)呈極顯著正相關.

表3 31種碳源主要成分的荷載系數

2.7 討論

2.7.1不同森林類型土壤理化性質的變化

森林類型的不同會導致凋落物和根系分泌物產生差異，凋落物和根系分泌物會對土壤理化性質產生影響，從而影響土壤微生物的結構和功能. 有研究表明，凋落物和根系分泌物對土壤微生物結構組成具有顯著影響[29]. 因此，研究不同森林類型中土壤理化性質和土壤微生物之間的關系，對于了解植被改變后土壤生態系統功能的改變十分重要. 該研究地點位于黑龍江黑嘴松雞國家自然保護區內，其森林系統屬于大小興安嶺森林交錯區，而且由于人為干擾和破壞，目前該地區森林以次生演替中的闊葉樹種和原始興安落葉松為主，不同類型植被交錯分布，是研究森林改變后土壤生態系統功能的良好區域.

該地區土壤pH呈酸性，范圍為4.39～6.03. 其中，落葉松林的土壤pH最低，為4.39，而白樺林的土壤pH最高，為6.03. 這些差異可能與不同凋落物的化學成分差異有關[30]. 與其他2種森林類型相比，落葉松林凋落物質量低，TN含量低，C/N高，木質素含量高，木質素/氮高. 因此，落葉松林凋落物的分解速度和植物養分的釋放速度逐漸減慢[30]. 這可能是造成落葉松林下土壤pH較低的原因. 此外，該研究還發現，與針葉林相比，闊葉林(白樺林和蒙古櫟林)生態系統中w(SOC)和w(TN)更高(見表1). 這與已有研究結果[31]一致，即闊葉林的土壤有機質和氮含量高于針葉林. 而且，一些研究也發現針葉林中的土壤養分含量低于闊葉林[32-33]. 闊葉林中w(SOC)和w(TN)高可能是因為其凋落物的持續輸入、根系效應以及土壤養分的周轉[34]；而落葉松林中的凋落物含有大量難分解的木質素和有機酸，因此與闊葉凋落物相比，落葉松林的凋落物更難分解. 有研究[35]表明，土壤C/N會影響土壤微生物的結構和功能. 該研究中，落葉松林中土壤C/N顯著高于白樺林，這與之前的研究結果不盡一致，有研究[36-37]表明，針葉林土壤中的有機碳含量更高，且具有較高的C/N. 這可能是因為該研究中落葉松林的群落類型單一，其凋落物成分單一，主要凋落物中的化學成分對土壤化學性質產生了顯著影響[38]. 已有研究[39-41]表明，地上樹種的組成比例會對土壤產生顯著影響，這與筆者所得結果一致.

注：B2為D-木糖；H1為α-D-乳糖；A2為β-甲基-D-葡萄糖苷；G2為α-D-葡萄糖-1-磷酸；E1為α-環式糊精；F1為肝糖；G1為D-纖維二糖；A4為L-精氨酸；B4為L-天門冬酰胺；C4為L-苯基丙酰胺；D4為L-絲氨酸；E4為L-蘇氨酸；F4為甘氨酰-L-谷氨酸；B1為丙酮酸甲酯；C1為吐溫40；D1為吐溫80；A3為D-半乳糖酸-γ-內脂；C2為i-赤蘚糖醇；D2為D-甘露醇；H2為D, L-α-磷酸甘油；G4為苯乙胺；H4為腐胺；E2為N-乙酰-D-葡萄糖胺；B3為D-半乳糖醛酸；F2為D-葡萄糖胺酸；C3為2-羥基苯甲酸；D3為4-羥基苯甲酸；E3為γ-羥基丁酸；F3為衣康酸；G3為α-丁酮酸；H3為D-蘋果酸. 下同.

注：圖中紅色表示對應樣本AWCD值較高，綠色表示AWCD值較低. 圖例數值表示多組數據之間的差異程度.

圖4 碳源利用圖譜主成分分析

2.7.2不同森林土壤微生物功能多樣性的變化

目前應用最為廣泛的群落多樣性指數為Shannon-Wiener指數和Simpson指數，主要用來衡量土壤微生物多樣性[42]. 通過對不同森林類型土壤微生物功能多樣性的研究表明，森林所導致的次生演替顯著改變了土壤微生物alpha功能多樣性(見表4). 該研究發現，闊葉林(白樺林和蒙古櫟林)土壤微生物的Shannon-Wiener指數顯著高于針葉林(落葉松林)，這與DENG等[43]的研究結果一致，其研究表明在溫帶森林生態系統，針葉林土壤微生物的Shannon-Wiener指數低于針闊混交林和闊葉林. 這說明土壤微生物功能多樣性與樹種相關，不同森林類型通過土壤理化性質的差異會對土壤微生物功能多樣性產生影響[44]. 由于興安落葉松林林分單一，凋落物主要以難分解的針葉為主，有機碳含量低，因此其供微生物利用的碳源也低，因此導致土壤微生物功能多樣性降低. 而與興安落葉松林相比，白樺林和蒙古櫟林植被組成復雜，凋落物種類多，而且分解速度快，可以提供大量土壤微生物可以利用的碳源，因此白樺林和蒙古櫟林的土壤微生物功能多樣性較高.

2.7.3不同森林類型土壤微生物碳源利用的變化

不同森林類型土壤微生物利用單一碳源時會出現一定差異. 該研究中落葉松林中土壤微生物對4-羥基苯甲酸、D,L-α-磷酸甘油具有較高的利用能力，而白樺林中土壤微生物對L-絲氨酸、γ-羥基丁酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖醛酸的利用效率較高，而蒙古櫟林中土壤微生物對肝糖、i-赤蘚糖醇的利用效率較高. 森林環境、土壤狀況以及植物群落的差異導致土壤微生物對各類底物的適應發生了變化[45]. 森林類型不同，其植物組成和相對豐度均不相同，不同森林類型中植物群落對環境的改變,尤其是土壤環境中微生物群落組成和結構的改造存在較大差異，進而導致微生物功能的改變，因此，表現為對不同碳源種類在利用能力上存在差異. 例如，曹宏杰等[46]研究表明，在不同植被演替階段，土壤微生物對碳源的利用率顯著不同，植物通過根系和凋落物向土壤中釋放大量有機物，為土壤微生物代謝活動提供大量碳源，在提供微生物繁殖所需養分的同時，會不斷改變土壤理化性質，進而對土壤微生物功能產生顯著影響. 因此，不同植被類型下土壤微生物群落組成結構差異尤其是功能菌群的差異可能是引起微生物代謝功能改變的重要原因[47]. 此外，不同森林類型下優勢碳源類型的差異反映了土壤微生物呼吸代謝底物的差異，這也反映出生態系統在演化過程中，植被群落結構和類型的差異、演替會影響土壤微生物的群落結構和功能[31]. 這種影響主要取決于凋落物組成和數量的變化，凋落物作為土壤有機質輸入的主要來源，其性質和數量等的變化必然會影響土壤微生物群落組成[48-49]，從而影響土壤微生物的代謝功能.

圖5 土壤微生物群落功能和環境因子的典型相關分析

表4 土壤環境因子與土壤微生物功能多樣性的相關性

2.7.4不同森林類型土壤微生物功能多樣性與土壤理化之間的關系

該研究表明，w(SOC)、w(TN)均與土壤微生物的Shannon-Wiener指數呈正相關，而土壤pH與土壤微生物的AWCD值呈負相關，這與鄧嬌嬌等[28]的研究結果不盡一致. 這表明該研究區域具有與溫帶森林生態系統不一致的特點，說明其受到了寒溫帶森林生態系統的影響. 森林植被發生演替后，會造成不同數量和質量的植物凋落物輸入土壤[50-52]，而不同植物種類之間的凋落物質量和數量將為土壤中不同種類的微生物提供支持[53-54]. 綜上，由于不同森林類型的凋落物組成差異所導致的土壤理化性質差異是影響土壤微生物結構和功能的主要原因.

土壤微生物是森林生態系統的重要組成部分，研究不同森林植被演替下植被變化與土壤微生物多樣性之間的相互影響，對于揭示土壤微生物、環境、植物之間的關系意義重大. Biolog-Eco法由于碳源種類等的限制不能全面地反映微生物的功能和多樣性，因此需要結合酶動力學、分子生物學尤其是高通量測序等手段，深入研究地上植被類型、組成和多樣性與土壤微生物結構、功能和多樣性的關系，探討森林類型對土壤微生物群落結構和功能的相對貢獻.

3 結論

a) 黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區內森林交錯區生態系統不同森林植被演替階段土壤微生物多樣性和功能發生了顯著改變. 闊葉林土壤微生物的Shannon-Wiener指數顯著高于興安落葉松林，其中白樺林最高，為3.24，興安落葉松林最低，為2.65. 從PCA和熱圖分析來看，不同林型土壤微生物對碳源的利用差異顯著. 白樺林和蒙古櫟林土壤微生物功能活性顯著高于原始的興安落葉松林.

b)w(SOC)和w(TN)是影響土壤微生物群落功能多樣性的主要因素，長期的森林植被演替改變了w(SOC)和w(TN)，從而影響了土壤微生物的功能多樣性.

致謝：感謝黑龍江中央站黑嘴松雞國家級自然保護區服務中心趙振柱主任、陳福元科長和李顯達科長在試驗設計和野外工作中提供的幫助.