多肋藻雌配子體種質(zhì)保存和擴(kuò)培的溫光條件研究

賽珊，趙楠，羅世菊，王偉偉，武瑞娜，李曉捷

（山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

多肋藻（Costaria costata）是一種一年生的大型褐藻，屬海帶目，海帶科，多肋藻屬。自然分布于太平洋北部沿岸潮間帶或潮下帶淺海區(qū)，其中日本北海道，朝鮮半島以及俄羅斯遠(yuǎn)東部分地區(qū)均有分布[1-4]。多肋藻是一種經(jīng)濟(jì)褐藻，通常用作海參、鮑魚等海珍品的飼料。近些年來，研究者發(fā)現(xiàn)從多肋藻中提取出的多肋藻多糖，具有調(diào)節(jié)血脂的作用，能抑制血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高[5-6]，多肋藻已成為海藻養(yǎng)殖的熱點(diǎn)種類之一。目前，多肋藻的繁育主要是利用常溫人工育苗和配子體克隆育苗2 種方式[7-8，10-11]。孫娟等[9]對(duì)多肋藻雌、雄配子體的研究發(fā)現(xiàn)雄配子體在不同溫度和光照條件下抗逆性較強(qiáng)，而雌配子體在強(qiáng)光照條件下易出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。現(xiàn)選多肋藻雌配子體為材料，摸索其適宜的種質(zhì)保存和擴(kuò)增培養(yǎng)的溫度和光照條件。

1 研究方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)庫保存的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的多肋藻雌配子體克隆系。培養(yǎng)液為加熱煮沸的過濾海水，添加ρ（NaNO3-N）為10 mg/L，ρ（KH2PO4-P）為1 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）材料預(yù)處理。將多肋藻克隆系用循環(huán)泵氣動(dòng)打散，其濾液經(jīng)400 目篩絹過濾，取適量濾液于直徑為9 cm 培養(yǎng)皿中。在顯微鏡（10×10 倍）下鏡檢打散的絲狀體，平均每段為3～4 個(gè)細(xì)胞、每個(gè)視野有4～5 個(gè)配子體段為宜。培養(yǎng)皿放置在低溫弱光[10 ℃，≤2 μmol/（m2·s）]條件下靜置一周使絲狀體段附著便于計(jì)數(shù)。

（2）方法。設(shè)置3 個(gè)溫度，分別為10、15 和20 ℃，每個(gè)溫度下設(shè)5 個(gè)光照強(qiáng)度，分別為10、20、40、60和80 μmol/（m2·s），共15 個(gè)試驗(yàn)組；每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)平行。試驗(yàn)進(jìn)行了4 個(gè)月，前13 d 每3 d 鏡檢一次，統(tǒng)計(jì)絲狀體段細(xì)胞數(shù)。13 d 后每5 d 鏡檢一次，拍照并觀測(cè)配子體生長(zhǎng)狀態(tài)。根據(jù)初始絲狀體細(xì)胞數(shù)（N0）和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)絲狀體細(xì)胞數(shù)（N1），按照公式RGR=100×[ln（N1）-ln（N0）]/t 計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)速率，其中，t 為試驗(yàn)天數(shù)（d）。

2 結(jié)果分析

2.1 試驗(yàn)前期（1—25 d）配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

（1）絲狀體段細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)前13 d 進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖1（a）（b）（c）。

圖1 10、15、20 ℃時(shí)配子體生長(zhǎng)狀態(tài)

（2）配子體生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。在10 ℃條件下，絲狀體細(xì)胞偏粗，見圖2（a）。10～40 μmol/（m2·s）時(shí)狀態(tài)較好；60 μmol/（m2·s）時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞色素不均勻的現(xiàn)象；80 μmol/（m2·s）時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，色素粒狀現(xiàn)象。15～20 ℃條件下，光照強(qiáng)度為10～40 μmol/（m2·s）時(shí)配子體生長(zhǎng)較快且枝條伸展，色素鮮亮，見圖2（b）；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)部分細(xì)胞出現(xiàn)色澤暗淡、色素降解現(xiàn)象，見圖2（c）；甚至部分細(xì)胞出現(xiàn)色素空、死亡現(xiàn)象，見圖2（d）。

2.2 試驗(yàn)中期（26—50 d）配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

試驗(yàn)第26—38 d，10～20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）條件下配子體狀態(tài)良好，溫度為15 ℃時(shí)，生長(zhǎng)尤其旺盛，分枝體復(fù)雜交錯(cuò)，見圖3（a）。10～15 ℃，40～60 μmol/（m2·s）時(shí)色素較淡，少部分色素空，見圖3（b）；20 ℃，40～60 μmol/（m2·s）時(shí)枝條不舒展，細(xì)胞發(fā)圓較明顯，見圖3（c）；10～20 ℃，80 μmol/（m2·s）時(shí)配子體生長(zhǎng)狀態(tài)較差，色素降解明顯，但絲狀體上長(zhǎng)出狀態(tài)良好的新分枝，見圖3（d）。

第38—50 d，10～20 ℃，10～80 μmol/（m2·s）條件下的配子體均進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。10～20 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)依然良好；40 μmol/（m2·s）時(shí)狀態(tài)較好，細(xì)胞色素淡、伸展，見圖4（a）；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)長(zhǎng)出新的分枝體，雖然部分細(xì)胞形態(tài)偏圓，色素偏暗，但分枝體有生長(zhǎng)且舒展，見圖4（b）。

圖2 試驗(yàn)前期配子體生長(zhǎng)狀態(tài)

圖3 試驗(yàn)中期（26—38 d）配子體生長(zhǎng)狀態(tài)

2.3 試驗(yàn)后期（50—120 d）配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

第50—80 天，10 ℃，10～80 μmol/（m2·s）時(shí)配子體同中期（38—60 d）時(shí)變化不明顯，依然正常生長(zhǎng)。15 ℃，10～40 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)良好，但生長(zhǎng)變慢；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有色素降解現(xiàn)象。20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）時(shí)配子體個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)膨大，色素淡的情況；40 μmol/（m2·s）時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞色素不均勻，粒狀現(xiàn)象；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)出現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

圖4 試驗(yàn)中期（38—50 d）配子體生長(zhǎng)狀態(tài)

第80—120 天，10 ℃，10～40 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)良好，依舊枝條伸展、色素鮮亮，見圖5（a）；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)部分細(xì)胞色素偏淡但分枝體舒展，見圖5（b）。15 ℃，10～20 μmol/（m2·s）時(shí)配子體部分細(xì)胞發(fā)圓，色素不均勻，見圖6（a）；40 μmol/（m2·s）時(shí)配子體細(xì)胞色素降解較明顯；60～80 μmol/（m2·s）時(shí)分枝體不伸展，半數(shù)細(xì)胞色素空、死亡，見圖6（b）；20 ℃，10～20 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)較差，色素降解、空，部分細(xì)胞膨大，見圖7（a）；40 ～60 μmol/（m2·s）時(shí)開始出現(xiàn)死亡細(xì)胞；80 μmol/（m2·s）時(shí)基本全部死亡，見圖7（b）。

圖5 試驗(yàn)后期（80—120 d）10 ℃時(shí)配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖6 試驗(yàn)后期（80—120 d）15 ℃時(shí)配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖7 試驗(yàn)后期（80—120 d）20 ℃時(shí)配子體的生長(zhǎng)狀態(tài)

3 討論

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，溫度為10 ℃，光照強(qiáng)度為10 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)比其他試驗(yàn)組都好，得出在低溫低光照時(shí)適宜配子體種質(zhì)保存。

光照強(qiáng)度在60～80 μmol/（m2·s）時(shí)，在試驗(yàn)前期絲狀體狀態(tài)差，部分細(xì)胞甚至死亡，在實(shí)驗(yàn)中期這些狀態(tài)差的絲狀體上又長(zhǎng)出新的枝條舒展的分枝體，在試驗(yàn)后期配子體在溫度越高時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)變差越明顯。分析認(rèn)為配子體對(duì)生存環(huán)境有一定的抗逆性，但光照強(qiáng)度超過60 μmol/（m2·s）時(shí)并不適宜長(zhǎng)期培養(yǎng)配子體。

孫娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雌配子體在光照強(qiáng)度超過40 μmol/（m2·s）時(shí)就出現(xiàn)萎縮衰退死亡，這和該研究前期結(jié)果一致；試驗(yàn)后期，在10 ℃條件下，光照強(qiáng)度超過40 μmol/（m2·s）時(shí)配子體狀態(tài)也較好，分析認(rèn)為孫娟等[9]試驗(yàn)進(jìn)行了4 周，該研究持續(xù)進(jìn)行4個(gè)月，培養(yǎng)時(shí)間不同配子體最終生長(zhǎng)狀態(tài)也不同。孫娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)在20 ℃，20 μmol/（m2·s）時(shí)雌配子體生長(zhǎng)速度最快，研究前期在15 和20 ℃，20 μmol/（m2·s）時(shí)生長(zhǎng)速度快，而在試驗(yàn)后期20 ℃，20 μmol/（m2·s）條件下配子體出現(xiàn)色素空、死亡現(xiàn)象。說明配子體并不適宜在高溫下進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。

4 結(jié)論

多肋藻雌配子體在溫度越高、光照越強(qiáng)時(shí)狀態(tài)越差，并不適宜在高溫和強(qiáng)光下進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。配子體在溫度為10 ℃，光照強(qiáng)度≤10 μmol/（m2·s）時(shí)適宜種質(zhì)保存；15～20 ℃，20 μmol/（m2·s）時(shí)適宜短期擴(kuò)增培養(yǎng)；15 ℃，20 μmol/（m2·s）時(shí)適宜長(zhǎng)期擴(kuò)增培養(yǎng)。