白花蛇舌草內生真菌BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901增殖和凋亡的作用研究

陳龍，陳裕鳳，張淼，李永燕，沈運連，許立拔

（廣西中醫藥大學，廣西南寧530200）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種以胃為原發部位的上皮源性惡性腫瘤，胃癌細胞惡性增殖和侵襲能力強，預后差，5年生存率較低［1-2］。目前，胃癌的主要治療手段是手術切除聯合化療，常用的化療藥物有5-氟脲嘧啶、阿帕替尼、奧沙利鉑、表阿霉素和多西他賽等，化療藥物有一定療效，但副作用大，對患者身體傷害較大，在臨床長期使用受限［3］。中醫藥作用緩和，常用于改善手術后并發癥，減輕放、化療的不良反應，從而提高患者的體質和生活質量。因此，利用中醫藥理論指導篩選天然產物，發現并開發出低毒高效的抗胃癌新藥意義重大。

白花蛇舌草［Hedyotis diffusaWilld.或Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.］屬于茜草科耳草屬植物，有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛的功效［4］，對大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等均有抑制作用［5-9］。內生真菌與宿主植物共生長，代謝產物豐富，很多內生真菌與宿主植物的活性成分和功效相似，同時內生真菌還有抑制有害細菌、分泌營養物質有助宿主生長的作用［10-11］。研究表明，多種內生真菌和宿主一樣具有抗腫瘤活性，如莪術內生真菌和宿主一樣具有抗肝癌和胃癌活性；同時內生真菌代謝產物如黃酮類化合物，也具有明顯的腫瘤抑制作用［12-14］。有研究表明，白花蛇舌草及其黃酮類化合物對人胃癌細胞SGC-7901具有明顯的抑制作用，并可誘導其凋亡［15-17］。目前，白花蛇舌草內生真菌及其代謝產物對胃癌的研究尚未見報道，本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法測定白花蛇舌草內生真菌BY1不同提取部位對SGC-7901細胞的增殖抑制作用和凋亡變化，探討白花蛇舌草內生真菌BY1治療胃癌的作用，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 菌株及腫瘤細胞株白花蛇舌草采集于廣西壯族自治區南寧市青秀區，經鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld）；白花蛇舌草內生真菌BY1菌株（BY1）由廣西壯瑤藥重點實驗室分離提供；人胃癌細胞SGC-7901購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 試劑RPMI-1640培養基（批號8118276）、0.25%胰蛋白酶（批號1951208）為賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司產品；胎牛血清（批號18060505）為浙江天杭生物科技股份有限公司產品；四甲基偶氮噻唑藍（MTT，批號413Y053）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS液，批號20181226）、二甲基亞砜（DMSO，批號821D038）、青鏈霉素混合液（批號20180927）和5-氟脲嘧啶（5-FU，批號1015D021）均為北京索萊寶科技有限公司產品；石油醚（批號20181024）、乙酸乙酯（批號20170103）、氯仿（批號20180305）和甲醇（批號20170613）均為國藥集團化學試劑有限公司產品；乙醇消毒液（批號20181030）為廣西博亨醫療用品有限公司產品。

1.3 儀器KQ-500DA數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S電子天平（感量：0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司）；Epoch2酶標儀（美國Bio-Tek公司）；ZW-A微量震蕩器（常州榮華儀器制造有限公司）；C170二氧化碳培養箱（德國BINDER公司）；CKX53倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；VORTFX-5漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；BSC-1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 方法

2.1 BY1不同部位提取液的制備取干燥BY1菌絲適量，剪碎，置于三角燒瓶中，加入10倍量石油醚，40 kHz超聲提取30 min，過濾，共3次。合并3次濾液，減壓濃縮（溫度不超過60℃）揮干溶劑，所得菌絲體按先后順序分別加入10倍量的乙酸乙酯、氯仿、甲醇超聲提取3次，合并濾液減壓濃縮至稠膏，分別得乙酸乙酯部位（1 g相當于106.38 g菌絲）、氯仿部位（1 g相當于200 g菌絲）和甲醇部位（1 g相當于84.74 g菌絲）稠膏，置于干燥器內保存備用。取無菌BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位在超凈工作臺內，使用旋渦混勻器，加入含10%胎牛血清的1640完全培養液，旋渦混勻稀釋成相應濃度的含培養基藥液。

2.2 細胞培養將人胃癌細胞SGC-7901接種于培養瓶，培養環境為二氧化碳培養箱，設置37℃、5%CO2、飽和濕度，培養液為含10%胎牛血清和1%青鏈霉素（含青霉素80 U/ml和鏈霉素0.08μg/ml）的1640完全培養液，2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次。

2.3 同濃度下BY1不同提取部位對人胃癌細胞株SGC-7901增殖抑制率的影響取BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位稠膏，加入含10%胎牛血清的1640完全培養液，調配終濃度均為250μg/ml，另設空白組和5-氟脲嘧啶組（25μg/ml）。取對數生長期人胃癌細胞SGC-7901，調節密度至5×104個/ml細胞懸液。在96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液（約5 000個/孔）。常規培養24 h后，吸棄原培養液，在相應孔中加入200μl相同濃度含完全培養基的藥液，每個樣品重復6個復孔。培養48 h后，每孔分別加入20μl MTT溶液（5 mg/ml）繼續孵育4 h，棄上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10 min使溶出物充分溶解，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔OD值，分別計算細胞生長抑制率。抑制率（%）=（空白組OD值-給藥組OD值）/空白組OD值×100%。

2.4 BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901半數抑制濃度（IC50）的影響參照文獻［18］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位設置5個濃度，分別為1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml，72μg/ml和30μg/ml；氯仿部位設置5個濃度，分別為500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml，61μg/ml和30μg/ml；甲醇部位設置5個濃度，分別為1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml，121μg/ml和60μg/ml；另設空白組。取對數生長期人胃癌細胞SGC-7901，調節密度至5×104個/ml細胞懸液，在96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。常規培養24 h后，吸棄原培養液，在相應孔中加入200μl不同濃度含完全培養基的藥液，每個樣品濃度重復6個復孔。培養48 h后，分別于每孔加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續孵育4 h后棄上清液，每孔加入100μl DMSO，振蕩10 min使溶出物充分溶解，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔OD值，分別計算細胞生長抑制率及各樣品半數抑制濃度（IC50）。

2.5 BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901細胞核凋亡形態的影響參考文獻［19］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位設置4個濃度，分別為1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml和72μg/ml；氯仿部位設置4個濃度，分別為500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml和61μg/ml；甲醇部位設置4個濃度，分別為1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml和121μg/ml；另設5-氟脲嘧啶組（10μg/ml）和空白組。取對數生長期的人胃癌細胞SGC-7901調整至1×106個/ml，接種至6孔板（內置無菌蓋玻片），每孔1 ml，約1×106個/孔，觀察細胞增長至約80%時，吸棄原培養液，按設計加入不同濃度的含藥培養基，每孔1 ml。繼續培養36 h后，吸棄原培養液，用PBS液2 ml清洗3次，再用10%中性福爾馬林液0.5 ml固定15 min后吸棄培養液。用PBS液2 ml清洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml，室溫避光染色20 min，用PBS液2 ml清洗3次，取出蓋玻片，晾干，用抗熒光淬滅封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞核凋亡形態并拍照。

2.6 統計分析使用SPSS 21.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組數據采用One-Way ANOVA分析，兩組間采用LSD test分析；非正態和/或方差不齊的數據，多組數據采用Kruskal-Wallis H分析，兩組間采用Mann-Whitney U分析。P＜0.05為有統計學差異。

3 結果

3.1 同濃度下BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901增殖的影響見表1。

表1 同濃度下白花蛇舌草內生真菌BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901增殖的影響（x±s，n=6）

表1 顯示，與空白組比較，BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位和5-氟脲嘧啶對人胃癌細胞SGC-7901均有顯著抑制作用（P＜0.01），細胞增殖抑制率分別為55.38%、58.69%、24.92%、65.03%。

3.2 BY1不同提取部位不同濃度對人胃癌細胞SGC-7901的影響見表2～表4、圖1～圖3。

表1 ～表3、圖1～圖3顯示，BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901均有明顯的細胞毒性作用，濃度-增殖抑制率曲線呈S型，符合Logistic曲線特征；與空白組比較，BY1不同提取部位各濃度OD值或增殖抑制率差異均具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01），BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位對人胃癌細胞SGC-7901的IC50值 分 別 為380.53±40.07μg/ml、177.37±11.53μg/ml和1 077.80±40.17μg/ml。

3.3 BY1不同提取部位對人胃癌細胞SGC-7901細胞核凋亡形態的影響見圖4～圖6。

在熒光顯微鏡下，空白組人胃癌細胞株SGC-7901細胞細胞核熒光反應較弱，細胞凋亡數目較少，形態規則；BY1不同部位對人胃癌細胞SGC-7901均有明顯的促進凋亡作用，細胞核形態隨著藥物濃度增大而發生核固縮聚集，細胞核不規則樣變，濃度越大，細胞核畸形數目增加；且細胞核熒光反應隨藥物濃度呈正相關，濃度越大，熒光反應加強，細胞凋亡數目增加，其中氯仿部位促進人胃癌細胞SGC-7901凋亡作用最為顯著。

表2 白花蛇舌草內生真菌BY1不同濃度乙酸乙酯部位對人胃癌細胞SGC-7901的影響（x±s，n=6）

圖1 白花蛇舌草內生真菌BY1乙酸乙酯部位對人胃癌細胞SGC-7901的增殖抑制曲線

表3 白花蛇舌草內生真菌BY1不同濃度氯仿部位對人胃癌細胞SGC-7901的影響 （x±s，n=6）

圖2 白花蛇舌草內生真菌BY1氯仿部位對人胃癌細胞SGC-7901的增殖抑制曲線

表4 白花蛇舌草內生真菌BY1不同濃度甲醇部位對人胃癌細胞SGC-7901的影響 （x±s，n=6）

圖3 白花蛇舌草內生真菌BY1甲醇部位對人胃癌細胞SGC-7901的增殖抑制曲線

圖4 白花蛇舌草內生真菌BY1乙酸乙酯部位對人胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡形態的影響

圖5 白花蛇舌草內生真菌BY1氯仿部位對人胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡形態的影響

圖6 白花蛇舌草內生真菌BY1甲醇部位對人胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡形態的影響

4 討論

胃癌是常見的消化道癌癥之一，胃內炎性環境是促進胃細胞癌變和生長的主要因素，已有研究表明，炎癥環境可促進多種癌癥形成和發展［20］。胃癌的發生發展與胃癌細胞的增殖和凋亡失衡密切相關，胃細胞DNA復制的不穩定性，導致細胞周期紊亂，可刺激胃細胞癌變，故治療胃癌，應抑制胃癌細胞增殖，并誘導其程序性死亡。胃癌易轉移，存活率低于其他腫瘤，一般發現已是中晚期，無法根治，只能進行長時間的放療、化療，但副作用大，嚴重損傷機體，降低了患者的生活質量。中醫藥在防治胃癌方面有著獨特的優勢，主要是通過抑制胃癌細胞增殖和促進其凋亡，從而達到抑制胃癌細胞生長的目的［21］。

本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法觀察白花蛇舌草內生真菌BY1不同提取部位對SGC-7901細胞的增殖抑制和促進凋亡作用。研究結果表明，白花蛇舌草內生真菌BY1不同提取部位對SGC-7901細胞呈濃度依賴性抑制，由強到弱依次為氯仿部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位，并可有效促進胃癌細胞凋亡，主要表現為癌細胞形態的改變，如核固縮、核碎片和聚集等，促凋亡作用呈劑量-效應關系。

白花蛇舌草內生真菌BY1對胃癌細胞具有良好的增殖抑制和促進凋亡作用，提示其可用于胃癌的防治，其作用機制可能與內生菌的抑菌、抗炎和改變胃內炎癥內環境有關；也可能與內生菌及其代謝產物有免疫調節作用，增強機體免疫功能，減少淋巴管和血管生成，抑制癌細胞的生長和轉移有關，具體機制尚有待進一步研究。