促紅細胞生成素對老年性聾小鼠炎性因子的調節作用

秦雪梅,孫 青*,曹德林,李菊紅,高 萍,郭志強

(1 復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻喉科,上海 201700;2 上海市青浦區朱家角人民醫院耳鼻喉科;*通訊作者,E-mail:13611976156@163.com)

老年性聾是指聽覺器官隨著年齡的增長而老化和退化,導致雙耳的感音神經性聽力損失。在此過程之中,首先是高頻,逐漸發展為中低頻,同時相應的言語辨別能力也會出現比較明顯的下降,值得注意的是,言語辨別力的損失相對較高,即言語識別率的閾值高于語音區域中純音的閾值[1]。造成老年性聾的因素涉及多方面,包括生理學、病理學、生物化學和分子學,相對應的發病機制也非常復雜,是多種因素共同作用之后所得到的結果。隨著全球老齡化問題的日益突出,全社會越來越重視老年性聾,學者們也借助多種先進手段對老年性聾的發病機制進行了越來越深入的探索。但是,目前對其發病機制尚未完全理解,這使得在老年性聾的預防和治療方面難以取得重大突破。

近年來,研究表明耳蝸是老年性耳聾發生后最容易受損的部位,耳蝸受血流的影響非常明顯,即便只出現輕微的血液微循環變化,也可能損傷內耳功能。而血脂代謝狀況、凝血功能狀況對機體血液微循環有著非常重要的影響。促紅細胞生成素(EPO)是一種激素糖蛋白分子,可以促進機體血液微循環,主要由胎兒肝臟和成年人腎臟產生,是具有分子量46 kD的糖蛋白細胞因子。近年來,研究發現[1]促紅細胞生成素和血管內皮因子對分化和成熟細胞(例如神經細胞)具有明顯的保護作用,并且它們的神經保護作用可以通過抑制細胞凋亡來實現,能夠使得促炎細胞因子,如白介素(IL)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的正常表達以及分泌受到明顯抑制,在中樞神經系統缺血缺氧性損傷、視網膜疾病和癲癇中起重要的神經保護作用[2-4]。也有研究結果證實,對于因使用慶大霉素或者缺血而導致的神經細胞以及毛細胞,EPO可以起到有效的保護作用[5]。基于以上研究基礎,我們建立老年性聾小鼠模型,應用EPO進行干預,探討其對血清和耳蝸中TNF-α、IL-6和IL-17的調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5周齡清潔級昆明小鼠60只,體質量(22±2)g,雌雄不限,耳廓反射正常,由南京大學動物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 小鼠在常溫安靜狀態下喂養,自由飲水,給與7 d的適應性喂養。標記稱重后,隨機分為空白對照組和造模組。造模組進一步隨機分為EPO組、生理鹽水組和模型組,每個組各15只小鼠。

1.2.2 造模方法 參考相關文獻[6-9],每只小鼠腹腔注射濃度為150 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液,每日1次,連續60 d。

1.2.3 干預方法 EPO組和生理鹽水組分別進行腹腔注射1 000 U/kg EPO和等量生理鹽水,均為2次/周,共8周。

1.2.4 標本采集 治療結束后,小鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉,沿腹中線剪開腹部,于下腔靜脈處,抽取2 ml靜脈血,離心后分離血清,置于-80 ℃冰箱中凍存,備用。

將小鼠耳蝸及前庭組織切除后,置液氮中10 min,勻漿機低速勻漿3 min,冰浴1 min,重復操作至組織完全裂解,冷凝處理后,以2 000 r/min的轉速離心20 min,取上清液于-80 ℃的冰箱中凍存。

1.3 指標檢測

1.3.1 ABR聽力測試 用藥前及停藥后,在隔音、屏蔽的房間內,用YJC-A誘發電位儀測量清醒小鼠的聽覺腦干反應[10]。將小鼠固定,引導電極放置在頭骨的頂部,參考電極和接地電極分別置于同側和對側乳突上,并用短聲刺激。聲音刺激器輸入波幅為0.1 ms的方波電脈沖,并通過耳機輸出,10次/s。以Ⅳ波剛出現時的刺激強度dB值為聽覺腦干反應(ABR)的閾值。

1.3.2 ELISA法測定蛋白表達 采用ELISA法進行檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表達,嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。利用ELISA酶標儀(ELX800)450 nm波長讀取每孔吸光度值。以標準曲線計算OD值和各項指標的血清含量。

1.3.3 免疫組織化學檢測蛋白陽性率 采用免疫組織化學技術進行檢測。取耳蝸組織制作石蠟切片,切取厚度為3 μm,按照所設定好的實驗步驟進行嚴格操作。DAB、IL-6和IL-17的一抗、二抗以及TNF-α均購自上海安妍生物有限公司。使用光學顯微鏡對相應的染色結果進行觀察以及拍攝。如細胞顏色呈現棕黃色,則屬于陽性結果。隨機抽取3個上皮細胞分布區,分別對著色強度以及陽性率作出客觀評分。陽性率<25%,25%-50%,51%-75%,>75%分別對應1分,2分,3分,4分。著色強度無明顯著色、淺黃色、棕黃色、黃褐色分別對應著0分,1分,2分,3分。兩者得分之和≤2分者為陰性,>2分者為陽性,計算陽性率。

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。引物由上海云序生物科技有限公司合成(見表1),相關試劑產自美國ABP Biosciences公司。嚴格按照說明書進行操作。反應體系:94 ℃ 5 min,循環1次;94 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,循環15次;93 ℃ 25 s,60 ℃35 s,72 ℃ 20 s,反復35次。在60 ℃完成對信號的有效收集以及對相應Ct值的有效讀取,通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對水平。

表1 引物信息

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 ABR閾值比較

干預前模型組和空白對照組間ABR閾值具有顯著性差異(P<0.05),說明造模成功。使用EPO進行干預后,EPO組ABR閾值較干預前明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),而生理鹽水組在EPO干預前后ABR閾值無明顯差異。EPO組干預后的閾值明顯低于生理鹽水組,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

2.2 各組血清中TNF-α、IL-6和IL-17表達比較

ELISA結果顯示:模型組血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組與模型組間血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量無明顯差異(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量顯著降低(P<0.05,見表3)。

表2 各組小鼠ABR閾值變化 (dB SPL)

2.3 各組耳蝸組織中TNF-α、IL-6和IL-17表達陽性率比較

免疫組化結果顯示:模型組IL-6、IL-17以及TNF-α陽性率明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組與模型組間IL-6、IL-17以及TNF-α陽性率比較,差異無統計學意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組耳蝸組織中IL-6、IL-17以及TNF-α的陽性率顯著降低(P<0.05,見表4)。

2.4 各組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達比較

實時熒光定量PCR結果顯示:模型組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相對表達與模型組比較,無顯著差異(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相對表達顯著降低(P<0.05,見表5)。

表5 耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達比較

3 討論

老年性耳聾主要與內部環境穩定性的下降以及生物體器官、組織和細胞的功能和結構隨著年齡的增長而退化有關,有研究表明炎癥可能是老年性耳聾病理改變的重要機制[11,12]。健康動物或者健康老年人的血清當中存在著包括TNF-α以及IL-6在內的高水平促炎性細胞因子[13]。多項實驗數據表明TNF-α以及IL-6促炎性細胞因子與多種年齡相關性疾病之間存在著非常密切的關系。本研究結果顯示,EPO組與生理鹽水組相比,TNF-αIL-6和IL-17的mRNA表達量明顯降低。這說明EPO干預能夠使得老年性聾小鼠模型相應的耳蝸組織以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的正常表達受到抑制,從而實現對局部炎癥反應的有效預防和緩解。分析原因可能是老年性聾小鼠相應的耳蝸組織以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的含量及表達水平都比正常小鼠超出很多,這些因子的高表達可能代表著局部炎癥損傷[14-17]。在受到EPO的干預之后,相對應的表達水平會出現明顯下降,表明其能有效減弱局部炎癥反應[18-21]。有研究結果證實,由噪音導致的耳聾患者或者由于免疫介導而導致的內耳疾病患者的耳蝸組織中,包括IL-10以及IL-6和TNF-α在內的各種促炎細胞因子與正常人相比明顯高表達[22]。這些結果進一步證實了促炎細胞因子與耳聾具有密切的聯系。

近年來,研究成果已證實了EPO能夠有效抑制炎癥反應和細胞凋亡,促進血管生成,同時還具有比較強大的神經保護功能[23,24]。另外還有部分研究證實EPO能夠使得線粒體的穩定狀態得以保持,從而減少局部細胞的凋亡[25]。本文實驗結果也顯示EPO對TNF-α、IL-6和IL-17的表達有明顯的下調作用,這表明EPO可能有效抑制了炎癥反應。但目前對IL-6和IL-17以及TNF-α在小鼠耳蝸組織當中復雜的作用機制還沒有足夠清晰的研究與闡明,需要本課題組后續進一步的研究。