早期梅毒合并HIV感染的MSM人群Treg細(xì)胞的研究

汪曉丹,張 明,李 娟,翁文佳,高艷青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100069;*通訊作者,E-mail:gaoyanqing@ccmu.edu.cn)

梅毒以細(xì)胞免疫為主,而HIV可以破壞機(jī)體的細(xì)胞免疫。人們推測(cè)兩種疾病或許有較廣泛的相互作用,如早期的一些研究顯示,梅毒會(huì)導(dǎo)致CD4計(jì)數(shù)下降、HIV載量升高[1],進(jìn)而推測(cè),合并梅毒可能會(huì)加快HIV感染進(jìn)展為AIDS;處于免疫缺陷狀態(tài)時(shí),梅毒可能會(huì)迅速由一期進(jìn)展為三期,甚至出現(xiàn)所謂的“惡性梅毒”[2-5]。查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)二者免疫方面相互作用的研究較少。所以本研究以男男性接觸者(men who have sex with men,MSM)為研究對(duì)象,從調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)入手,初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象均來(lái)自2009-2014年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院性病艾滋病診療中心隨訪的MSM隊(duì)列人群。其中早期梅毒組患者26例(包括一期、二期梅毒、早期潛伏梅毒,且不伴HIV感染),HIV組18例[均為HIV感染者(外周血CD4≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月)],合并感染組18例[早期梅毒合并HIV患者(外周血CD4≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月)],健康組20例(MSM隊(duì)列中性別和年齡相匹配的未暴露于HIV和梅毒的健康者)。收集病例過(guò)程中不包括年齡小于18歲、合并有活動(dòng)性肺結(jié)核的患者。所有梅毒患者均未進(jìn)行驅(qū)梅治療,所有HIV感染者均未進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy,HAART)治療。所有入選者一般情況見(jiàn)表1。

表1 四組患者的基線資料

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 健康對(duì)照組采集新鮮血。取新鮮采集的EDTA抗凝全血離心去除血漿后,用PBS稀釋一倍,加至淋巴細(xì)胞分離液上層,2 500 r/min,離心25 min,取中間白膜層(即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層),PBS洗滌2遍,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。早期梅毒組、HIV感染組、合并感染組均為2009-2014年隨訪期間凍存PBMC,于42 ℃恒溫水浴鍋,快速晃動(dòng)凍存管,使凍存的細(xì)胞在1 min內(nèi)解凍,獲得較高細(xì)胞存活率。

1.2.2 熒光抗體染色 利用熒光抗體染色,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-FITC CD8a APC。選擇CD4+CD25+FoxP3+來(lái)界定Treg細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞百分比 采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀,分析早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組及健康組外周血中Treg細(xì)胞百分比。

1.2.4 儀器及試劑 TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(北京六一儀器廠);恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-FITC CD8a APC(美國(guó)eBioscience公司)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 四組間Treg細(xì)胞的比較

采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了HIV感染組和早期梅毒組Treg細(xì)胞所占PBMC百分比明顯高于健康組(0.80%±0.10%,0.74%±0.07%vs0.32%±0.05%,均P<0.05);合并感染組Treg細(xì)胞所占PBMC百分比明顯高于健康組(1.01%±0.09%vs0.32%±0.05%,P<0.001,見(jiàn)圖1);其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與健康組比較,* P <0.05,* * * P <0.001圖1 Treg細(xì)胞占PBMC百分比在四組人群中的比較Figure 1 Comparison of Treg percentage in PBMC between four groups

2.2 不同分期單純梅毒與合并感染Treg細(xì)胞的比較

我們將單純梅毒與合并感染組患者按照不同臨床分期進(jìn)行分組,由一期進(jìn)展為二期梅毒時(shí),單純梅毒組和合并感染組Treg細(xì)胞比率均呈上升趨勢(shì),而合并感染者Treg比率上升更快(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同分期單純梅毒與合并感染組Treg細(xì)胞的比較Figure 2 Comparison of Treg percentage between different syphilis staging

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群,具有廣泛的免疫抑制活性。越來(lái)越多針對(duì)人體和動(dòng)物模型的研究顯示Treg細(xì)胞可以抑制多種慢性感染的免疫反應(yīng),包括結(jié)核分枝桿菌[6]、幽門螺桿菌[7]、乙肝病毒感染[8]、HIV感染[9]以及惡性瘧原蟲[10]等。

我們的研究結(jié)果顯示,梅毒患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比正常對(duì)照組顯著升高,這與裘宇容等[11]報(bào)道一致。梅毒螺旋體侵入機(jī)體后,機(jī)體隨即啟動(dòng)一系列細(xì)胞及體液免疫,但梅毒螺旋體依然能夠逃避這些免疫并形成持久的感染。其免疫逃避機(jī)制除了免疫原性較弱[12],膜蛋白抗原變異[13]及抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用受損[14]之外,一個(gè)重要的原因是梅毒螺旋體可能觸發(fā)機(jī)體免疫抑制系統(tǒng),造成感染的持續(xù)和播散[15]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體的抗原TpF1可促進(jìn)二期梅毒患者外周血Treg水平升高[15]。升高的Treg可下調(diào)早期梅毒的各項(xiàng)免疫因子,這或許就是梅毒患者經(jīng)久不愈的原因。

已證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制機(jī)體CD4+和CD8+T細(xì)胞的特異性抗HIV-1免疫反應(yīng)[16,17]。許多證據(jù)表明:外周血Treg的數(shù)目和比例與病程慢性化有直接關(guān)系。對(duì)于丙肝及乙肝患者,Treg可通過(guò)下調(diào)抗原特異性T細(xì)胞的反應(yīng)而導(dǎo)致感染的持續(xù)[18,19]。但在HIV感染中,Treg細(xì)胞的功能還未完全闡明。我們發(fā)現(xiàn)HIV感染組Treg比率明顯高于健康組,這與Andersson等[20]研究結(jié)論一致。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn),血清固定更容易在HIV合并早期梅毒患者中發(fā)生。而其他多項(xiàng)研究[21,22]提示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在梅毒血清固定患者的比例明顯高于正常人。我們的研究發(fā)現(xiàn)合并感染組Treg明顯高于其他組,進(jìn)一步分析不同梅毒分期Treg細(xì)胞的變化發(fā)現(xiàn),在梅毒由一期進(jìn)展至二期過(guò)程中,合并感染組Treg上升速率高于單純梅毒組,提示合并感染組的細(xì)胞抑制更為明顯。由于患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例異常增高,細(xì)胞免疫功能受到抑制,機(jī)體雖經(jīng)過(guò)常規(guī)抗生素治療,但仍有少量梅毒螺旋體存在,持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,導(dǎo)致血清固定的發(fā)生,因此,推測(cè)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在梅毒合并HIV患者血清固定的發(fā)生中可能起著一定的作用。