早期梅毒合并HIV感染的MSM人群Treg細胞的研究

汪曉丹,張 明,李 娟,翁文佳,高艷青

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院皮膚科,北京 100069;*通訊作者,E-mail:gaoyanqing@ccmu.edu.cn)

梅毒以細胞免疫為主,而HIV可以破壞機體的細胞免疫。人們推測兩種疾病或許有較廣泛的相互作用,如早期的一些研究顯示,梅毒會導致CD4計數下降、HIV載量升高[1],進而推測,合并梅毒可能會加快HIV感染進展為AIDS;處于免疫缺陷狀態時,梅毒可能會迅速由一期進展為三期,甚至出現所謂的“惡性梅毒”[2-5]。查閱文獻,發現二者免疫方面相互作用的研究較少。所以本研究以男男性接觸者(men who have sex with men,MSM)為研究對象,從調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)入手,初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象均來自2009-2014年首都醫科大學附屬北京佑安醫院性病艾滋病診療中心隨訪的MSM隊列人群。其中早期梅毒組患者26例(包括一期、二期梅毒、早期潛伏梅毒,且不伴HIV感染),HIV組18例[均為HIV感染者(外周血CD4≥350個/μl,感染HIV時間>6個月)],合并感染組18例[早期梅毒合并HIV患者(外周血CD4≥350個/μl,感染HIV時間>6個月)],健康組20例(MSM隊列中性別和年齡相匹配的未暴露于HIV和梅毒的健康者)。收集病例過程中不包括年齡小于18歲、合并有活動性肺結核的患者。所有梅毒患者均未進行驅梅治療,所有HIV感染者均未進行高效抗逆轉錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy,HAART)治療。所有入選者一般情況見表1。

表1 四組患者的基線資料

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 健康對照組采集新鮮血。取新鮮采集的EDTA抗凝全血離心去除血漿后,用PBS稀釋一倍,加至淋巴細胞分離液上層,2 500 r/min,離心25 min,取中間白膜層(即單核細胞和淋巴細胞富集層),PBS洗滌2遍,得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。早期梅毒組、HIV感染組、合并感染組均為2009-2014年隨訪期間凍存PBMC,于42 ℃恒溫水浴鍋,快速晃動凍存管,使凍存的細胞在1 min內解凍,獲得較高細胞存活率。

1.2.2 熒光抗體染色 利用熒光抗體染色,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-FITC CD8a APC。選擇CD4+CD25+FoxP3+來界定Treg細胞。

1.2.3 流式細胞儀檢測Treg細胞百分比 采用FACSCalibur型流式細胞儀,分析早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組及健康組外周血中Treg細胞百分比。

1.2.4 儀器及試劑 TGL-16G臺式離心機(北京六一儀器廠);恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司);FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)。CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-FITC CD8a APC(美國eBioscience公司)。

1.3 數據統計分析

2 結果

2.1 四組間Treg細胞的比較

采用流式細胞技術分析了HIV感染組和早期梅毒組Treg細胞所占PBMC百分比明顯高于健康組(0.80%±0.10%,0.74%±0.07%vs0.32%±0.05%,均P<0.05);合并感染組Treg細胞所占PBMC百分比明顯高于健康組(1.01%±0.09%vs0.32%±0.05%,P<0.001,見圖1);其余各組間差異無統計學意義。

與健康組比較,* P <0.05,* * * P <0.001圖1 Treg細胞占PBMC百分比在四組人群中的比較Figure 1 Comparison of Treg percentage in PBMC between four groups

2.2 不同分期單純梅毒與合并感染Treg細胞的比較

我們將單純梅毒與合并感染組患者按照不同臨床分期進行分組,由一期進展為二期梅毒時,單純梅毒組和合并感染組Treg細胞比率均呈上升趨勢,而合并感染者Treg比率上升更快(見圖2)。

圖2 不同分期單純梅毒與合并感染組Treg細胞的比較Figure 2 Comparison of Treg percentage between different syphilis staging

3 討論

調節性T細胞是CD4+T細胞的一個亞群,具有廣泛的免疫抑制活性。越來越多針對人體和動物模型的研究顯示Treg細胞可以抑制多種慢性感染的免疫反應,包括結核分枝桿菌[6]、幽門螺桿菌[7]、乙肝病毒感染[8]、HIV感染[9]以及惡性瘧原蟲[10]等。

我們的研究結果顯示,梅毒患者外周血調節性T細胞比正常對照組顯著升高,這與裘宇容等[11]報道一致。梅毒螺旋體侵入機體后,機體隨即啟動一系列細胞及體液免疫,但梅毒螺旋體依然能夠逃避這些免疫并形成持久的感染。其免疫逃避機制除了免疫原性較弱[12],膜蛋白抗原變異[13]及抗體介導的調理作用受損[14]之外,一個重要的原因是梅毒螺旋體可能觸發機體免疫抑制系統,造成感染的持續和播散[15]。最近一項研究發現梅毒螺旋體的抗原TpF1可促進二期梅毒患者外周血Treg水平升高[15]。升高的Treg可下調早期梅毒的各項免疫因子,這或許就是梅毒患者經久不愈的原因。

已證實調節性T細胞能抑制機體CD4+和CD8+T細胞的特異性抗HIV-1免疫反應[16,17]。許多證據表明:外周血Treg的數目和比例與病程慢性化有直接關系。對于丙肝及乙肝患者,Treg可通過下調抗原特異性T細胞的反應而導致感染的持續[18,19]。但在HIV感染中,Treg細胞的功能還未完全闡明。我們發現HIV感染組Treg比率明顯高于健康組,這與Andersson等[20]研究結論一致。

我們的前期研究發現,血清固定更容易在HIV合并早期梅毒患者中發生。而其他多項研究[21,22]提示CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在梅毒血清固定患者的比例明顯高于正常人。我們的研究發現合并感染組Treg明顯高于其他組,進一步分析不同梅毒分期Treg細胞的變化發現,在梅毒由一期進展至二期過程中,合并感染組Treg上升速率高于單純梅毒組,提示合并感染組的細胞抑制更為明顯。由于患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例異常增高,細胞免疫功能受到抑制,機體雖經過常規抗生素治療,但仍有少量梅毒螺旋體存在,持續刺激機體產生抗體,導致血清固定的發生,因此,推測CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在梅毒合并HIV患者血清固定的發生中可能起著一定的作用。