HPLC法同時(shí)測(cè)定山西不同區(qū)域黃芩葉中3種黃酮類成分含量

喬麗芳,王喜明,楊瑩瑩,高文軍,李衛(wèi)紅

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院分析儀器室,太原 030006;*通訊作者,E-mail:lwh191@soho.com)

黃芩葉為唇形科植物黃芩屬(ScutellariabaicalensisGeorgi)多年生草本植物黃芩的干燥葉。黃芩葉中黃酮類成分具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降壓、降血脂、擴(kuò)張血管、增加腦和冠脈血流量等多種藥理活性,并且有提高機(jī)體免疫力等活性和高效低毒的特點(diǎn),對(duì)頑固性失眠亦有明顯的改善作用[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究,充分肯定了黃芩葉的藥用價(jià)值[2,3]。現(xiàn)代研究證實(shí)黃芩莖葉中主要含有黃酮類、有機(jī)酸類、二萜類、揮發(fā)油類、多糖類等資源性化學(xué)成分[4,5]。黃芩傳統(tǒng)藥用其根,莖葉一向被廢棄。山西是黃芩主產(chǎn)地之一,在全省各種中藥材中分布面積最廣,應(yīng)充分利用被廢棄的黃芩葉資源,加強(qiáng)黃芩全草資源的可持續(xù)利用,有效提高黃芩葉的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值[6,7]。

本實(shí)驗(yàn)基于文獻(xiàn)[8-10],收集了36批次來(lái)自山西不同區(qū)域的黃芩葉樣品,并采用HPLC法同時(shí)測(cè)定36批次來(lái)自山西不同區(qū)域的黃芩葉3種黃酮類成分的含量并評(píng)價(jià)不同區(qū)域黃芩葉之間的異同,為非傳統(tǒng)藥用部位黃芩葉的資源循環(huán)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters ARC型高效液相色譜儀(四元泵,PDA檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,Empower 3化學(xué)工作站);島津分析天平(AUW220D,日本島津);中草藥粉碎機(jī)(FW-135天津市泰斯特儀器有限公司);超純水系統(tǒng)(HHitech和泰);超聲波多頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

野黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110842-201709,純度91.7%),芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司,批號(hào):PRF9121944,純度98%),白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司,批號(hào):PRF9110703),甲醇和乙腈為色譜純,其它試劑均為分析純,水為自制超純水。

供試材料為采自山西省36個(gè)產(chǎn)地的黃芩葉(見(jiàn)表1)。

表1 樣品來(lái)源及編號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml含野黃芩苷1.958 mg的儲(chǔ)備液25 ml、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷1.004 mg儲(chǔ)備液25 ml、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷1.137 mg的儲(chǔ)備液25 ml,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備 采摘的黃芩葉在陰涼處晾干,粉粹,備用。取其粉末(過(guò)4號(hào)篩)約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇20 ml,稱定質(zhì)量,密塞,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)40 min,放冷至室溫,再稱定質(zhì)量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,制得供試品溶液。

2.2 色譜條件

Ameritech C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-甲醇-0.1%甲酸水溶液線性梯度洗脫(見(jiàn)表2);流速:1 ml/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μl;檢測(cè)波長(zhǎng):278 nm。

表2 梯度洗脫條件

2.3 專屬性考察

分別吸取上述各對(duì)照品溶液適量,混合,制得混合對(duì)照品溶液,分別吸取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液以及甲醇空白溶液各10 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。

1.野黃芩苷(scutellarin);2.芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranside);3.白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷(chrysin-7-O-β-D-glucuronide)圖1 混合對(duì)照品、供試品、空白樣品的色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances,sample,blank sample

由圖1可知,在野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上,供試品色譜圖中顯示相同保留時(shí)間的色譜峰,空白溶液無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述各對(duì)照品溶液適量,置于5 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,制得每1 ml含野黃芩苷391.6 μg、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷120.5 μg、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷56.84 μg的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5,1,5,10,15,20 μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,記錄色譜圖。以待測(cè)成分含量(x,μg)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出,野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷分別在含量為0.195 8-7.831 μg,0.060 27-2.411 μg和0.028 42-1.137 μg的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考察

取供試品溶液10 μl,注入液相色譜儀,重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果表明,野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面積的RSD分別為0.15%,0.08%,0.11%,儀器精密度良好(見(jiàn)表4)。

2.6 重復(fù)性考察

精密稱取同一批樣品(絳縣南樊鎮(zhèn)藥物培植場(chǎng)7號(hào))適量,制得供試品溶液,共6份,分別取樣10 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,并計(jì)算含量。結(jié)果表明,野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷的平均含量分別為3.30%,1.11%,0.10%,RSD分別為1.16%,0.92%,2.47%(見(jiàn)表4),表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取供試品(絳縣南樊鎮(zhèn)藥物培植場(chǎng)7號(hào))溶液一份,分別于0,6,12,18,24,48 h時(shí)取樣10 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果表明,野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面積的RSD分別為0.35%,0.97%,2.81%(見(jiàn)表4),表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 三種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢測(cè)限

表4 三種成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性 (%,n=6)

2.8 加樣回收率考察

取供試品(絳縣南樊鎮(zhèn)藥物培植場(chǎng)7號(hào))約0.1 g,精密稱定,共6份,分別加入一定含量的野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,按測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品含量,并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 三種成分的加樣回收率

結(jié)果表明,3種檢測(cè)指標(biāo)的加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均符合要求,表明本方法具有良好的檢測(cè)性能。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的供試樣品,按供試品溶液制備方法,制得供試品溶液,按測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算得各樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可得出,在山西境內(nèi)不同區(qū)域的黃芩葉中三種黃酮類成分的含量,野黃芩苷>芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷>白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷,野黃芩苷的含量集中在2.11%-3.43%之間,芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量集中在0.61%-2.03%之間,白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量集中在0.01%-0.73%之間。

3 提取條件的選擇和色譜分析測(cè)定條件的選擇

3.1 提取溶劑濃度的考察

本研究分別考察了60%,70%濃度的乙醇對(duì)3種成分提取率的影響。發(fā)現(xiàn)60%乙醇對(duì)野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷的提取率高些,所以選擇60%乙醇作為提取溶劑。

3.2 提取時(shí)間的選擇

考察不同超聲提取時(shí)間(10,20,30,40,50 min)對(duì)提取率的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),提取率逐漸增高,但是超過(guò)40 min后,提取率差別不大。考慮到時(shí)間成本和能耗,我們選擇超聲提取時(shí)間為40 min。

3.3 提取次數(shù)考察

考察了不同提取次數(shù)(1次和2次),發(fā)現(xiàn)第1次已基本提取完全,第2次只有少量殘留,所以選擇一次提取。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇,通過(guò)對(duì)野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷混合對(duì)照品溶液的全波長(zhǎng)掃描,發(fā)現(xiàn)野黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)為334 nm,芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷最大吸收波長(zhǎng)為336 nm,白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷最大吸收波長(zhǎng)為267 nm,結(jié)合3D圖譜以及各波長(zhǎng)時(shí)3個(gè)峰面積的變化程度,最終選擇了278 nm為本次實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

表6 樣品中3個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果

3.5 色譜系統(tǒng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)流動(dòng)相甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行了考察,比較了分離度、峰形、分析時(shí)間等因素后,選擇了甲醇-乙腈-水系統(tǒng)。

3.6 柱溫的選擇

通過(guò)比較25,30,35,40 ℃柱溫,30 ℃時(shí)分離度,峰形相對(duì)較好。

3.7 流動(dòng)相種類及濃度的選擇

考察了乙腈-甲酸水,甲醇-甲酸水,甲醇-乙腈-甲酸水三種流動(dòng)相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈-0.1%甲酸水可以滿足本實(shí)驗(yàn)的需求,故流動(dòng)相選擇為甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液。

4 結(jié)論

山西作為黃芩藥材的主產(chǎn)地之一,有著較大的栽培面積以及栽培歷史,每年的黃芩葉產(chǎn)量十分巨大,大部分未能被有效地利用起來(lái)。本研究首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定山西境內(nèi)黃芩葉中3種黃酮類成分的方法,該方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率,表明檢測(cè)方法可行。應(yīng)用所建立的方法測(cè)定不同區(qū)域黃芩葉中的3種成分的含量,其中野黃芩苷的含量最高。這為黃芩葉資源的利用提供了翔實(shí)的科學(xué)依據(jù),為山西黃芩資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。