豨薟草提取物對冠狀動脈結扎大鼠心肌AKT及ERK1/2表達的影響*

寶玲玲 ，李娜 ，曹莉 ，樊帆 ，王慧

（1.內蒙古自治區國際蒙醫醫院病理科，呼和浩特 010065；2.內蒙古醫科大學附屬醫院急診科，呼和浩特 010059）

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態[1]。正常情況下心臟活動所需要的能量靠有氧代謝提供，當某種原因導致心肌血液供需失衡，就會造成心肌缺血，冠心病是引起心肌缺血最主要的病因[2]。豨薟草能抗血栓形成，改善微循環，有研究表明豨薟草提取物對壓力超負荷型心肌重構具有一定的保護作用，豨薟草提取液可通過降低實驗性急性心肌缺血模型大鼠血清丙二醛（MDA）含量而產生對急性心肌缺血的保護作用[3]。文章對該藥提取物進行了有關心肌缺血損傷藥效學試驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠90只，雄性，體質量180～220 g，由內蒙古大學實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（蒙）2016-0002。

1.2 受試藥物及試劑 豨薟草提取物提取方法，采用8倍量70%乙醇，浸潤豨薟草2 h，加熱回流提取3 次（第 1 次 2.5 h，第 2 次 1 h，第 3次 1 h），回收乙醇，減壓干燥即得。人擬日用生藥量為30 g，豨薟草由內蒙古自治區國際蒙醫醫院提供。枸櫞酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司。枸櫞酸，國藥集團化學試劑有限公司。無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司。氯化鉀，磷酸氫二鉀，國藥集團化學試劑有限公司。水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司。二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司。磷酸氫二鉀，國藥集團化學試劑有限公司。磷酸二氫鈉，國藥集團化學試劑有限公司。氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司。TMS-P超敏試劑盒，福建邁新生物技術開發有限公司。DAB顯色試劑盒，福建邁新生物技術開發有限公司。磷酸化蛋白激酶（AKT）北京博奧森生物技術有限公司。絲裂原活化蛋白激酶1/2（ERK1/2）單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 儀器 BX53型光電顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司生產。JKDP2型電熱恒溫培養箱：廈門醫療電子儀器廠生產。TP1020型自動脫水機，德國徠卡生產。YG-280KX型攤片機，湖北孝感市陽光神琦醫用科技有限公司生產。YG-280KX型烤片機，湖北孝感市陽光神琦醫用科技有限公司生產。Leica切片機，德國徠卡生產。

1.4 動物模型的建立及分組給藥 90只SPF級SD大鼠，雄性，按體質量隨機分為假手術組、模型對照組、豨薟草提取物低劑量組（2.70 g生藥/kg）、豨薟草提取物中劑量組（5.40 g生藥/kg）、豨薟草提取物高劑量組（10.80 g生藥/kg）、硝酸異山梨酯組（3 mg/kg），每組15只。灌胃給藥，體積為10 mL/kg，假手術組和模型對照組灌胃等體積蒸餾水。腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）進行麻醉，氣管插管后連接呼吸機[4]。沿著胸骨左緣3～4肋骨間隙開胸，暴露心臟，用無創縫合線在左心耳根部下方2 mm處結扎，斷其血流，心肌逐漸泛白可證明手術成功，將心臟送回胸腔，閉合胸腔[5]。假手術組只穿線不結扎。恢復胸腔負壓，術后縫合，每層均撒青霉素鈉粉，術后第2天每只大鼠腹腔注射青霉素4萬U/d，連續3 d以防止術后感染[6]。連續給藥4周。末次給藥1 h后，腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）進行麻醉，腹主動脈采血檢測谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸磷酸激酶（CK-MB），處死動物，取心臟福爾馬林固定，用于蘇木精-伊紅染色（HE）及免疫組化染色。

1.5 缺血區心肌組織HE染色 取缺血區心肌組織于福爾馬林中固定24 h后，將心肌組織從固定液中取出，脫水后石蠟包埋。石蠟切片透明劑（Ⅰ）浸泡 10 min，透明劑（Ⅱ）浸泡 10 min，無水乙醇（Ⅰ）浸泡3 min，無水乙醇（Ⅱ）浸泡3 min，95%乙醇浸泡3 min，85%乙醇浸泡 3 min，70%乙醇浸泡 3 min，蒸餾水浸泡5 min。HE染色5 min，流水沖洗10 s，1%鹽酸乙醇浸泡 5s，蒸餾水洗 1min，0.5%HE 染色 3min，蒸餾水洗5 s，80%乙醇浸泡10 s，95%乙醇浸泡30s，無水乙醇浸泡5min，二甲苯浸泡10min，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下進行觀察。心臟病理分級標準：0級，無病變；1級，局灶性的間質反應；2級，多處局灶性損害，肌纖維腫脹斷裂；3級，退行性損害伴玻璃樣壞死，部分心肌細胞溶解消失；4級，左心室片狀透壁壞死，肉芽組織增生，呈單核細胞浸潤[7]。

1.6 缺血區心肌細胞AKT及ERK1/2的表達的檢測 大鼠缺血區心肌組織石蠟切片，60℃烘烤4 h，石蠟切片透明劑（Ⅰ）浸泡10 min，透明劑（Ⅱ）浸泡10 min，無水乙醇（Ⅰ）浸泡3 min，無水乙醇（Ⅱ）浸泡3 min，95%乙醇浸泡3 min，85%乙醇浸泡3 min，70%乙醇浸泡3 min，蒸餾水浸泡3 min。3% H2O2去離子水孵育5 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。于枸櫞酸鈉緩沖溶液中（pH7.0）高壓修復5 min。血清封閉 15 min，PBS 稀釋的一抗（AKT 1∶450，ERK1/2 1∶400），于37℃孵育4 h。PBS沖洗3次。滴加生物素標記的二抗，37℃孵育1 h，PBS緩沖液沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，于37℃孵育30 min。緩沖液沖洗3次。滴加二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑。清水沖洗。HE復染3 min，自來水沖洗3 s，1%鹽酸乙醇5 s，清水沖洗1 min，中性樹膠封片，免疫組化染色圖片采用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若滿足方差齊性采用LSD檢驗，若不滿足方差齊性采用Dunnet’s C 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 豨薟草提取物對冠脈結扎大鼠心肌酶的影響及病理形態的檢測結果 與空白對照組相比模型對照組血清LDH有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型對照組相比較，豨薟草提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組以及硝酸異山梨酯組血清 LDH 有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。與空白對照組相比，模型對照組血清CK差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比較，豨薟草提取物高劑量組以及硝酸異山梨酯組血清CK 差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表 2。與空白對照組相比，模型對照組血清CK-MB差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比較，豨薟草提取物中劑量組、高劑量組以及硝酸異山梨酯組血清CK-MB 差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表 3。與空白對照組相比，模型對照組血清AST差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型對照組相比較，豨薟草提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組以及硝酸異山梨酯組血清 AST 差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表4。與空白對照組正常心肌組織比較，模型對照組 HE 染色分級差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型對照組相比，豨薟草提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組和硝酸異山梨酯組心肌組織HE染色分級差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表 5、圖 1。

圖1 各組HE染色的結果（×200）Fig.1 HE staining results in each group（×200）

表1 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清LDH 的影響（±s）Tab.1 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum LDH in rats with myocardial ischemia（±s）

表1 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清LDH 的影響（±s）Tab.1 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum LDH in rats with myocardial ischemia（±s）

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 LDH（U/L）- 964.32±347.61- 1 353.64±375.46 2.70 g 生藥/kg 1 263.85±525.72 5.40 g 生藥/kg 1 136.74±374.42 10.80 g 生藥/kg 1 325.65±342.58 3 mg/kg 1 083.36±241.43

表2 豨薟草提取物大對鼠心肌缺血模型血清 CK 的影響（±s）Tab.2 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK in rats with myocardial ischemia（±s）

表2 豨薟草提取物大對鼠心肌缺血模型血清 CK 的影響（±s）Tab.2 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK in rats with myocardial ischemia（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 CK（U/L）- 421.90±182.26- 739.10±133.56*2.70 g 生藥/kg 593.30±195.38 5.40 g 生藥/kg 534.90±128.94 10.80 g 生藥/kg 474.10±155.69#3 mg/kg 466.30± 94.68#

表3 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清CK-MB 的影響（±s）Tab.3 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK-MB in rats with myocardial ischemia（±s）

表3 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清CK-MB 的影響（±s）Tab.3 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK-MB in rats with myocardial ischemia（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 CK-MB（ng/mL）- 721.81±212.58- 1 287.48±212.37*2.70 g 生藥/kg 1 159.93±239.54 5.40 g 生藥/kg 986.32±249.51#10.80 g 生藥/kg 925.62±254.48#3 mg/kg 861.67±217.67#

表4 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清AST 的影響（±s）Tab.4 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum AST in rats with myocardial ischemia（±s）

表4 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型血清AST 的影響（±s）Tab.4 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum AST in rats with myocardial ischemia（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 AST（U/L）- 122.71±24.67- 166.37±23.79*2.70 g 生藥/kg 148.53±27.75#5.40 g生藥/kg 131.59±25.36#10.80 g 生藥/kg 126.18±26.31#3 mg/kg 129.75±23.48#

表5 豨薟草提取物大鼠心肌缺血模型HE染色分級的影響（±s）Tab.5 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on HE staining grade of myocardial ischemia model in rats（±s）

表5 豨薟草提取物大鼠心肌缺血模型HE染色分級的影響（±s）Tab.5 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on HE staining grade of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12 3.56±0.47*2.70 g 生藥/kg 3.12±0.53#5.40 g 生藥/kg 2.74±0.46#10.80 g 生藥/kg 2.51±0.52#3 mg/kg 2.67±0.46#劑量 HE分級-0±0-

2.2 對AKT及ERK1/2表達的影響 與空白對照組相比，模型對照組大鼠心肌細胞AKT的表達差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比，豨薟草提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組和硝酸異山梨酯組心肌細胞AKT的表達差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表6、圖 2。與空白對照組相比，模型對照組大鼠心肌細胞ERK1/2表達差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比，豨薟草提取物中劑量組、高劑量組和硝酸異山梨酯組ERK1/2表達差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表 7、圖 3。

圖2 血清AKT表達的結果（×200）Fig.2 Results of serum AKT expression（×200）

圖3 血清ERK1/2表達圖片（×200）Fig.3 Results of serum ERK1/2 expression（×200）

表6 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型AKT表達的影響（±s）Tab.6 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on AKT expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

表6 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型AKT表達的影響（±s）Tab.6 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on AKT expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 AKT表達灰度值-71.36±16.52- 149.35±12.67*2.70 g生藥/kg 121.52±13.51#5.40 g生藥/kg 116.64±14.47#10.80 g 生藥/kg 108.76±15.75#3 mg/kg 97.83±16.48#

表7 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型ERK1/2表達的影響（±s）Tab.7 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on ERK1/2 expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

表7 豨薟草提取物對大鼠心肌缺血模型ERK1/2表達的影響（±s）Tab.7 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on ERK1/2 expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組豨薟草提取物低劑量組豨薟草提取物中劑量組豨薟草提取物高劑量組硝酸異山梨酯組動物數15 10 11 12 11 12劑量 ERK1/2表達灰度值- 116.68±17.43- 163.75±18.57*2.70 g 生藥/kg 151.81±16.24 5.40 g 生藥/kg 141.65±15.47#10.80 g 生藥/kg 138.97±17.46#3 mg/kg 129.62±15.79#

3 討論

血壓降低及冠狀動脈阻塞均可直接導致心臟供血減少引起心肌缺血。心瓣膜病、心肌本身病變及血黏度變化也會使心臟供血減少，其中最常見的原因是冠狀動脈粥樣硬化[8]。心肌酶是存在于心肌的多種酶的總稱，包括AST、LDH、CK及其CK-MB等。AST存在于心肌、腎臟和肝臟等，以心肌含量最高，心肌、肝、腎病變時。組織損傷時AST才能在血清中測得。心肌梗死時，m-AST先于s-AST而升高[9]。乳酸脫氫酶存在于機體所有組織細胞的胞質內，是一種糖酵解酶。乳酸脫氫酶可催化乳酸脫氫生成丙酮酸。LDH同功酶的分布有明顯的組織特異性，有心肌酶釋放入血LDH1＞LDH2，利用此指標可以觀察診斷心肌疾病[10]。肌酸激酶以心肌和骨骼肌含量多，肌酸激酶主要存在于細胞質和線粒體中，是與細胞內能量運轉、肌肉收縮有直接關系的重要激酶[11]。肌酸激酶活性測定可以用于心肌病的診斷[12]。本研究結果表明，豨薟草提取物治療組大鼠的心肌組織HE染色分級顯著降低，心肌細胞肌纖維腫脹斷裂及溶解消失癥狀減輕，心肌AST、CK及CK-MB均顯著降低，LDH雖有所降低但未見顯著性差異。

AKT為磷酸化蛋白激酶，它調節許多過程，包括代謝、增殖、細胞存活和血管生成。磷酸化蛋白激酶在成纖維細胞中是催化失活的[13]。AKT可被血小板衍生的生長因子激活，AKT以不依賴于轉錄的方式抑制細胞凋亡，然后激活細胞凋亡機制的組分磷酸化和滅活。AKT還通過磷酸化細胞凋亡信號調節激酶的磷酸化進而調節細胞存活[14]。磷酸化細胞凋亡信號調節激酶的磷酸化降低由氧化應激刺激的激酶活性，從而防止細胞凋亡。AKT可介導胰島素樣生長因子-I的抗細胞凋亡作用[15]。AKT信號通路被認為是預防心肌缺血損傷的重要級聯信號通路，在氧化應激、炎癥、鈣超載、自噬、內質網應激和線粒體障礙等多種機制中處于核心位點，與心肌缺血損傷的嚴重程度密切相關。ERK1/2可以使脯氨酸相鄰的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化[16]。ERK1/2的活化是將信號從細胞膜表面受體轉導至核的關鍵，細胞信號傳遞通路是由一個小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級聯反應[17]。其活化的中心是使原癌基因Ras進行鳥苷酸交換變成其活化形式Ras2GTP。ERKl/2是Ras通路中重要的信號分子，位于Ras的下游，主要由生長因子受體介導激活。ERK1/2能減少血小板源性生長因子-2β的表達。ERKl/2通過磷酸化抗凋亡分子，同時激活轉錄因子，進而產生抗凋亡作用[18]。ERKl/2途徑參與炎癥因子、激素、生長因子、絲裂原受體活化信號的轉導，細胞的增殖主要與這條通路有關，ERKl/2與心肌缺血損傷的修復存在密切關系。本研究結果表明，豨薟草提取物可以通過增加AKT及ERK1/2表達起到對心肌細胞的保護作用，減輕因心肌缺血引起的心肌細胞損傷。

綜上所述，本實驗通過對心肌缺血模型大鼠心肌酶的檢測、缺血區心肌組織HE染色、免疫組化檢測AKT及ERK1/2在缺血區心肌細胞的表達證明豨薟草提取物對心肌缺血引起的心肌細胞損傷具有的保護作用。