大鼠尾椎間盤不同切片方式及染色方法的組織學觀察比較

趙宇朋，周平輝，官建中

（1．蚌埠醫學院第一附屬醫院骨科，蚌埠 233000；2．安徽省組織移植重點實驗室，蚌埠 233000）

椎間盤疾病是引起下腰痛的最常見原因之一。在全球范圍內，椎間盤疾病的終生患病率高達總人口的84%，而且嚴重的椎間盤疾病致殘率較高，易導致巨大的醫療/社會成本。最新研究表明，全美國每年用于診斷和治療椎間盤退行性變的費用高達859～1000億美元[1-2]。

大鼠是骨科研究常用的實驗動物之一，因其尾椎與人體椎間盤有相似的解剖構造，研究者常用大鼠尾椎間盤模擬正常的人體椎間盤[3-4]。而組織形態學觀察常用于椎間盤退行性變的臨床診斷及基礎研究，在深入探討其發病機制及治療方法上起著重要的作用[5-6]。椎間盤切片方法包括石蠟切片和冷凍切片。因切片方法及染色步驟的不同，椎間盤染色結果在大體形態學、免疫組織化學和免疫熒光等方面均存在差異[7]。筆者查閱文獻發現，很少有研究者探究大鼠尾椎間盤不同切片方式及染色方法得到的觀察結果的差異性。因此，本研究擬制作橫切及縱切的SD大鼠尾椎間盤石蠟切片標本及冷凍切片標本，并分別行蘇木精-伊紅染色（HE染色）、Masson染色、番紅-固綠染色、甲苯胺藍染色及免疫熒光染色，觀察椎間骨性結構、軟骨終板、纖維環組織、髓核組織四層結構的組織學特點，以及一型膠原蛋白（collagen typeⅠ，COL-Ⅰ）、二型膠原蛋白（collagen typeⅡ，COL-Ⅱ）和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）在椎間盤組織中的表達及分布情況，從而分析對比2種切片方法和5種染色方法對病理檢測結果的影響，為椎間盤相關研究提供理論及實踐數據[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠12只，平均體質量為250g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK（魯）2019-0003]，飼養于蚌埠醫學院科研樓組織工程學實驗室[SYXK（皖）2017-001]。本研究經蚌埠醫學院實驗動物福利倫理委員會審查批準，編號為倫動科批字2019第100號。

1.2 實驗試劑及實驗儀器

HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、番紅-固綠染色試劑盒及甲苯胺藍染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠COL-Ⅰ多克隆抗體（工作液體積稀釋比例為1∶200）、兔抗鼠COL-Ⅱ多克隆抗體（1∶200）和兔抗鼠GAG多克隆抗體（1∶200）均購自美國Affinity公司；羊抗兔Cy3抗體（1∶150）購自武漢三鷹生物技術有限公司；Hoechst 33342（4 μg/mL）、質量分數為4%的多聚甲醛溶液、PBS平衡鹽溶液和EDTA脫鈣液（pH7.2）均購自北京蘭杰柯科技有限公司。

熒光顯微鏡（型號Obsever Z1）購自德國ZEISS公司；冷凍切片機（型號CM3050 S）購自德國Leica公司；石蠟切片機（型號EM2245）購自北京盛科信德科技有限公司。

1.3 實驗取材

腹腔麻醉后以頸椎脫臼法處死SD大鼠，然后于動物手術室依次剝離大鼠尾部皮膚、筋膜、肌層，取出圓環狀尾椎間盤標本，放置于4%多聚甲醛溶液中浸泡12 h后取出。用PBS沖洗標本3次，最后放置于EDTA脫鈣液（pH7.2）中脫鈣30 d，每隔24 h更換一次新鮮的脫鈣液。

1.4 切片方法

分別采用冷凍切片法和石蠟切片法進行組織切片（均包括橫切和縱切），兩種切片制作方法的對比如表1所示。無論冷凍切片還是石蠟切片，均需經過梯度乙醇溶液脫水及包埋機處理。相比冷凍切片而言，石蠟切片的操作步驟繁瑣，須經高溫處理，但組織切片較薄，不易脫片。

表1 大鼠尾椎間盤冷凍切片及石蠟切片的方法對比Table 1 Comparison of preparation methods for frozens sections and paraffin sections of caudal intervertebral discs in rats

1.5 染色方法

1.5.1 HE染色

石蠟切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液脫水后，用蘇木精浸染6 min，隨后經鹽酸乙醇溶液分化數秒，用伊紅浸染10 min，最后用梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。冷凍切片無需二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液處理，于常溫下晾干后直接行HE染色。

1.5.2 Masson染色

石蠟切片脫蠟脫水同HE染色，隨后用蘇木精染色細胞核5 min，經鹽酸乙醇溶液分化數秒后，用溫水返藍4～6 min；用Masson試劑盒中麗春紅試劑溫染及冰醋酸浸洗后，將切片浸入2%苯胺藍液復染，最后行二甲苯透明及中性樹膠封固。冷凍切片無需二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液處理，于常溫下晾干后直接依上述步驟行Masson染色。

1.5.3 番紅-固綠染色

石蠟切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液脫水后，用1%番紅染液浸染2 min，用1%固綠染液對比染色1 min；經體積分數95%的乙醇溶液分化數秒后，用番紅染色3 min；再經體積分數為95%的乙醇溶液分化數秒后，自然晾干，二甲苯透明，中性樹膠封固。冷凍切片無需二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液脫水，其余操作同石蠟切片。

1.5.4 甲苯胺藍染色

石蠟切片經二甲苯脫蠟后，梯度乙醇溶液脫水，用甲苯胺藍染色約30 min，隨后用自來水沖洗，冰醋酸分化至細胞核清晰，再用乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。冷凍切片無需二甲苯脫蠟及梯度乙醇溶液脫水，其余操作同石蠟切片。

1.5.5 免疫熒光染色

將4 ℃保存的石蠟切片置于25 ℃復溫，然后轉移至60 ℃烤箱中烘片2 h；進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS洗滌3次，每次5 min；經枸櫞酸鈉緩沖液沸水浴15 min行抗原修復，PBS洗滌15 min；經透膜液透膜，用免疫組織化學筆將切片四周畫一圈，加入正常山羊血清封閉20 min；加入一抗（分別為兔抗鼠COL-Ⅰ、COL-Ⅱ和GAG多克隆抗體，工作液體積稀釋比例均為1∶200），孵育過夜；PBS洗滌后，加入二抗（Cy3標記的羊抗兔抗體，工作液體積稀釋比例為1∶150），孵育2h；經PBS漂洗3次，每次5 min，隨后用Hoechst 33342（2.5 μg/mL）染色細胞核，并用甘油封固；切片干燥后，置于熒光顯微鏡下觀察。冷凍切片無需二甲苯脫蠟，也不需要行抗原修復，其余操作同石蠟切片。

1.6 實驗觀察指標

主要通過熒光顯微鏡于明場及熒光狀態下觀察骨、軟骨終板、椎間關節、纖維環組織和髓核組織的形態完整性，以及COL-Ⅰ、COL-Ⅱ和GAG蛋白在上述尾椎間盤組織結構中的分布情況，放大倍數分別為100倍及200倍。

2 結果

2.1 組織學染色

2.1.1 尾椎間盤石蠟切片標本染色

大鼠尾椎間盤石蠟切片標本用不同方法染色的結果如圖1所示。HE染色可見：椎間盤縱切面上骨、軟骨終板、纖維環組織和髓核組織四層結構清晰；纖維環組織呈環狀排列，纖維蛋白排列柔和規整，纖維環組織與髓核界限較為清晰；纖維環細胞與髓核細胞呈梭形，核質分明，紅藍顏色適度；軟骨下骨及骨小梁結構完整。Masson染色可見：椎間盤形態結構完整、清晰；膠原纖維呈藍色，膠原纖維層與肌層紅藍相間，界限明顯，可見明顯的膠原纖維網；椎間盤纖維環排列規整柔順，與髓核組織分界清晰明顯，能較好地反映纖維組織的形態。番紅-固綠染色可見：縱切面上，椎間盤四層結構清晰可見，紅綠對比明顯，軟骨基質呈均勻紅色；纖維環-髓核組織分界線大致清晰，但不如Masson染色界限明顯，能較好地呈現椎間盤結構的正常形態。甲苯胺藍染色可見：縱切面上，椎間盤形態大致清晰，上下軟骨終板呈藍紫色；軟骨細胞核染色清晰，與纖維環分界清楚，能夠較好地呈現椎間軟骨形態。

2.1.2 尾椎間盤冷凍切片染色

大鼠尾椎間盤冷凍切片標本用不同方法染色的結果如圖1所示。HE染色、Masson染色、番紅-固綠染色和甲苯胺藍染色結果均顯示：整個冷凍切片大致能表現出髓核組織、纖維環組織、上下軟骨終板及椎骨；但是整體而言，相對于石蠟切片，整張冷凍切片破碎感明顯，髓核組織不能完全呈現；另外，用同樣的染色液染色時，冷凍切片比石蠟切片的顏色更為艷麗。

圖1 大鼠尾椎間盤石蠟切片（縱切）和冷凍切片（縱切）不同方法染色的結果對比（×100）Figure 1 Comparison of different staining results of longitudinal paraffin sections and longitudinal frozen sections of caudal intervertebral discs in rats (×100)

2.2 免疫熒光染色

大鼠椎間盤石蠟切片的免疫熒光染色效果很差（圖略），可能與制片過程中高溫導致結合抗原脫落有關；而冰凍切片的免疫熒光染色結果良好，如圖2和圖3所示。其中，免疫熒光試劑Hoechst將纖維環細胞及髓核細胞的細胞核染成藍紫色，COL-Ⅰ、COL-Ⅱ和GAG經Cy3試劑交聯后被染成明顯的紅色熒光。100倍視野下可觀察到椎間盤組織的宏觀形態，以明確髓核組織與纖維環組織的形態分布（圖2）。由圖2可見，在椎間盤橫切面上，纖維環組織與髓核組織界限分明；COL-Ⅰ在纖維環組織中顯著表達；COL-Ⅱ在髓核及纖維環中均表達，但在髓核中表達較多；GAG多由髓核細胞及髓核樣細胞分泌，廣泛存在于髓核組織中，而在纖維環組織中幾乎不表達。

進一步提高觀察倍數，在200倍視野下更清晰地觀察椎間盤組織中形態蛋白的表達分布差異（圖3），A為纖維環的免疫熒光結果，B為髓核組織的免疫熒光結果。由圖3可見，COL-Ⅰ在纖維環組織中較多表達；COL-Ⅱ在纖維環組織及髓核組織中均表達，但在髓核組織中表達較多；GAG在髓核組織中熒光明亮飽滿，在纖維環組織中僅有少量偽影存在。

圖2 大鼠尾椎間盤冷凍切片（橫切）的免疫熒光結果（×100）Figure 2 Immunofluorescence results of cross frozen sections of caudal intervertebral discs in rats (× 100)

圖3 大鼠尾椎間盤橫切面上COL-Ⅰ、COL-Ⅱ和GAG的局部表達情況（×200）Figure 3 Local expressions of COL-Ⅰ, COL-Ⅱ and GAG in cross sections of caudal intervertebral discs in rats (×200)

3 討論

椎間盤退行性疾病是我國乃至世界范圍內最為常見的骨科疾病之一，是胸腰背疼痛的主要原因，給社會帶來很大的健康隱患和經濟負擔。正常人體椎間盤位于上下椎體之間，其包括內側的髓核、外側的纖維環及上下軟骨終板[8]。正常的椎間盤具有一個密閉的微環境，營養物質供應依賴于椎間盤上下軟骨終板的細小毛細血管，使椎間盤擁有分散應力、維持椎體高度和正常運動的功能，正常的椎間盤微環境具有低氧、高乳酸、低pH及高滲的特點[9]。纖維環組織是非均一性的組織，其由20～25層同心圓環狀結構組成。大體上，纖維環組織由內向外可分為內、中、外3個區域，各區域的細胞類型、微觀結構和生化組成各不相同。纖維環組織中含有豐富的Ⅰ型膠原纖維，其與椎間韌帶一起維持了脊柱前屈后伸等運動。纖維環的破裂是椎間盤退行性變發生的病理生理機制[10]。髓核組織呈膠凍樣，包括細胞及細胞外基質，細胞包括髓核間充質干細胞及終末分化的髓核細胞，細胞外基質包括聚集蛋白聚糖、蛋白多糖，以及包繞成核狀的Ⅱ型膠原纖維[8]。

正常狀態下細胞外基質的合成與分解處于動態平衡，而炎性因子誘導的髓核細胞外基質穩態的打破是發生椎間盤退行性變的最主要原因[11]。病理學診斷能在宏觀形態和微觀結構上反映炎性因子、細胞質蛋白等在椎間盤組織中的表達水平，同樣，特殊染色方法在辨認椎間盤骨、軟骨終板、纖維環組織和髓核組織四層結構的完整性上有不可忽視的作用[12-13]。

HE染色是最常用的染色方法之一[14]，能清晰地顯示椎間盤各層組織，在分辨骨及軟骨終板的形態方面具有參考意義。Masson染色對于椎間盤膠原纖維的分辨及髓核組織與纖維環組織的分辨明顯優于HE染色，可見明顯的膠原纖維網，能較好地反映纖維組織的形態，是檢測椎間盤組織較為適合的染色方法之一。番紅-固綠染色及甲苯胺藍染色在椎間盤各層結構的顯色及組織形態學方面都不及Masson染色，但是可以明顯看到骨與軟骨的分布及各層結構，對于椎間盤椎小關節失衡和軟骨終板炎的診斷有臨床價值[15]。相對于上述染色方法，免疫熒光技術在組織膠原蛋白定位的研究上具有敏感度高、特異度高和精確度高的特點，可用于微量蛋白的檢測，以及COL及GAG分布的定量分析[16-17]。本研究中，免疫熒光染色結果如圖2所示，纖維環組織中膠原蛋白大部分為COL-Ⅰ，伴有少量COL-Ⅱ；髓核組織中膠原蛋白大部分為COL-Ⅱ，少量為COL-Ⅰ；GAG多由髓核細胞及髓核樣細胞分泌。

石蠟切片及冷凍切片均是檢測椎間盤組織病理形態學的常規方法[18]。本研究發現，石蠟切片操作復雜，經過高溫、浸蠟等操作時，椎間盤組織表面的待測抗原極易脫落，熒光染色結果很不理想[19]。相反，冷凍切片無需高溫操作，制片方法簡單易行；而且椎間盤橫切片熒光蛋白完整，層次分明；免疫熒光結果清亮通透，熒光層次分明，纖維環及髓核組織中的COL-Ⅰ、COL-Ⅱ和GAG等成分熒光明顯，有良好的臨床基礎及實驗價值。但是對于椎間盤形態學檢測，石蠟切片的效果要優于冷凍切片。石蠟切片所制的椎間盤標本經染色后軟骨基質損傷較少，切片染色較好，纖維環組織及髓核組織細胞形態良好，細胞核染色清晰可見，整個切片經染色后幾乎無脫片；而且染色步驟順利，所需染色時間短。對于冷凍切片而言，其切片厚度約為9 μm，厚于石蠟切片的5μm；即使使用防脫載玻片，經染色后，整個切片仍明顯脫片，染色情況較差；而且染色過程耗時較長，切片著色結果較差。

本研究還對比了大鼠尾椎間盤橫向及縱向切片情況，發現對于石蠟切片而言，因骨、軟骨終板、纖維環組織和髓核組織的組織密度不同，在本實驗條件下很難制作出椎間盤橫向切片；但是對于冷凍切片而言，因為包埋劑的軟化作用，可以制作出厚度約為9或10 μm的椎間盤橫向或縱向切片。進一步觀察椎間盤的組織學形態，發現縱向的椎間盤切片包括了骨、軟骨終板、纖維環組織及髓核組織四層結構，有良好的臨床價值；但對于觀察椎間盤髓核組織是否膨出，纖維環組織的完整性，COL-Ⅰ、COL-Ⅱ及GAG的分布情況而言，橫向的椎間盤切片有組織學優勢[20]。

病理學檢測是研究椎間盤退行性變的實驗基礎，但大多數實驗人員在判斷及選擇切片形式及染色方法上耗費了大量的時間與精力。本研究比較了大鼠尾椎間盤不同切片方式及染色方法的組織學觀察結果差異性，為相應的基礎研究者提供了一定的理論依據及實驗經驗。