1型糖尿病早期大鼠空腸的神經功能及組織形態學變化

王 嫚，祗明花，耿旭芳，佟苗苗，梁紅玉，趙 丁

（河北醫科大學藥學院，石家莊 050017）

糖尿病是一類以體內血糖水平過高為特征的代謝性疾病，可伴有腹瀉、便秘、腹痛和大便失禁等胃腸并發癥[1-2]。糖尿病腸病是糖尿病胃腸并發癥的主要表現之一，占糖尿病并發神經病變的10%～20%[3]；且隨著病程進展，此類患者可能出現嚴重腹瀉，甚至脂肪瀉。盡管糖尿病的發病率很高，容易引起多種器官的功能障礙，但是到目前為止，糖尿病腸病的發病機制仍未闡明；其可能的誘發因素包括高血糖、胃腸神經病變、胃腸平滑肌變化和腸道菌群失調等[4-5]。由于腸道功能在糖尿病發病過程中至關重要，很可能是糖尿病使動因素，因此越來越多的學者開始關注糖尿病進程中腸道的改變，以探索早期干預糖尿病的新方法。

腸神經系統在胃腸功能調節方面起重要作用，主要包括肌間神經叢和黏膜下神經叢。腸肌間神經叢通過釋放興奮性和抑制性神經遞質調控腸道運動功能，如乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、P物質、血管活性肽和一氧化氮（nitric oxide，NO）等[6]。其中興奮性神經遞質ACh和抑制性神經遞質NO是兩種支配胃腸運動的重要神經遞質，兩者的主要功能分別是促進和抑制胃腸蠕動。通過鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導建立糖尿病大鼠模型的大部分研究均采用16～24周造模大鼠，最早的也是造模8周[7-10]。本實驗室曾研究發現，造模4周的糖尿病大鼠存在胃排空異常現象，并且大鼠胃底環形肌和縱行肌的神經支配功能受損，主要涉及膽堿能神經和氮能神經[11]。本研究在此基礎上，同樣采用STZ誘導的大鼠模型，重點探討早期糖尿病大鼠空腸組織形態和神經調節功能的改變，以期為糖尿病的預防和治療提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗用清潔級雄性SD大鼠，體質量為180～220 g，鼠齡6～8周，由河北省實驗動物中心[SCXK（冀）2013-1003]提供。動物實驗在河北醫科大學[SYXK（冀）2013-1004]進行，大鼠保持12 h晝夜模式，適應性喂養4 d，每天更換飲用水、飼料和墊料。本研究的動物實驗通過河北醫科大學倫理委員會審查（批準號為1603024）。

1.2 試劑與儀器

STZ購自美國Cayman Chemical公司。N’-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl esterhydrochloride，L-NAME）、河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）和阿托品購自美國Sigma公司。甲基硫酸新斯的明（neostigmine methylsulfate）購自上海信誼金朱藥業有限公司。乙酰膽堿轉移酶JA67-11購自杭州華安生物技術有限公司。兔鏈霉卵白素-生物素法免疫組織化學檢測試劑盒SP-9001和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。JZ101型張力換能器購自高碑店市新航機電設備有限公司。S48型電子刺激器購自美國Grass Technologies公司。MedLab-U/4cs生物信號采集處理系統購自南京市美易科技有限公司。

1.3 動物模型的建立及取材

大鼠共20只，采用單純隨機抽樣法分為正常對照組8只和糖尿病模型組12只。糖尿病模型組大鼠造模前禁食不禁水12 h，然后腹腔注射1%STZ（用0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制，使用劑量為60 mg/kg）建立糖尿病模型[8,11-12]；正常對照組大鼠腹腔注射等容積緩沖液。STZ注射3d后，尾靜脈采血，并檢測空腹血糖水平，每周1次，連續4周。以空腹血糖值≥16.7 mmol/L[13]時認為大鼠造模成功，血糖值低于該值時不計入實驗結果。最終12只大鼠成模8只，成模率為66.6%。

造模后4周以頸椎脫臼法處死大鼠，并迅速打開腹腔，找到蔡氏韌帶[14]。每次實驗均在蔡氏韌帶附近截取空腸約5 cm。空腸標本沿腸系膜處切開，在改良的K-H液（含碳酸氫鈉16.3 mmol/L、氯化鈉133 mmol/L、葡萄糖7.8 mmol/L、硫酸鎂0.61 mmol/L、氯化鈣2.52 mmol/L、磷酸二氫鈉1.35 mmol/L和氯化鉀4.7 mmol/L）中反復漂洗。一部分腸組織用于電生理實驗，余下部分用于HE染色。

1.4 電場刺激誘發大鼠空腸平滑肌收縮反應變化

取長8 mm×寬2 mm的空腸環形肌標本，小心去除黏膜層。將去黏膜的肌條連接張力換能器，固定于盛有37 ℃的K-H液中，并持續通入含95% O2和5% CO2混合氣體的恒溫浴槽中，用電生理記錄儀記錄肌條的等長收縮活動。實驗前給予肌條1 g的前負荷，每15 min更換一次營養液，平衡1 h待肌條活動平穩后，開始電場刺激實驗，結果以法碼定標（g為單位）反映收縮反應強度。實驗結束前加入0.1 μmol/L TTX，孵育30 min后再次給予電場刺激，確認電場刺激誘發的反應為神經源性反應。另外，空腸肌條電場刺激誘發的收縮反應若能被1 μmol/L阿托品完全阻斷，表明引起平滑肌收縮的興奮性神經遞質為乙酰膽堿。

收縮反應的電場刺激參數：電壓為100 V，頻率為20 Hz，波寬1 ms，刺激時程10 s，刺激間隔100 s，刺激20 min[15]。在進行電場刺激10 min后，于浴槽內分別加入100 μmol/LLNAME或1 μmol/L新斯的明，繼續進行電場刺激10 min。記錄肌張力變化，觀察一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑及膽堿酯酶（cholinesterase，AChE）抑制劑對電場刺激誘發大鼠空腸環形肌收縮反應的影響，前者顯示氮能神經功能，后者顯示膽堿能神經功能。每組抽取5只大鼠用于電場刺激實驗。

1.5 空腸組織HE染色

空腸組織不剔除黏膜，用固定液固定24h后，進行常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。然后制成5 μm切片，進行HE染色。接著觀察并測量內環肌和外縱肌的肌層厚度，計算絨腺比。絨腺比即絨毛長度（絨毛與腸腺連接處到絨毛頂端的距離）與腸隱窩深度（絨毛與腸腺連接處到腸腺基底的距離）的比值。營養生理學研究表明，絨腺比可反映小腸的消化吸收功能[16]。該值越大表明消化吸收功能越強，動物生長發育迅速；反之，該值越小，表明消化吸收功能越弱，動物生長發育緩慢。

1.6 免疫組織化學染色

將空腸組織切片進行脫蠟、水化后，浸入組織抗原修復液中進行抗原熱修復，自然冷卻至室溫；在組織上滴加過氧化氫溶液、山羊血清封閉液，減少非特異性染色；滴加乙酰膽堿轉移酶抗體（工作液稀釋比例為1∶100），陰性對照滴加PBS代替抗體，之后4 ℃反應過夜；滴加生物素二抗工作液和辣根過氧化物酶標記的鏈卵白素工作液，DAB顯色液顯色；蘇木精染色細胞核；脫水，透明，中性樹脂封固，光學顯微鏡下觀察免疫組織化學染色情況，目的蛋白陽性表達呈褐色。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。各組實驗結果數據用x-±s表示。兩組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和血糖值的變化

與同周期正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠的飲水量和排尿量明顯增多，毛色暗淡無光澤，尾部皮膚的顏色明顯變深。在飼養期間，正常對照組大鼠的體質量持續增加，而糖尿病模型組大鼠的體質量逐漸下降；與同周期正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠的體質量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01，圖1A）。

正常對照組大鼠血糖水平正常且穩定，糖尿病模型大鼠的血糖濃度則＞16.7 mmol/L，并且在整個飼養期間血糖濃度均保持在16.7 mmol/L以上；與同周期正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠的血糖水平明顯升高（P＜0.01，圖1B）。

2.2 NOS抑制劑及AChE抑制劑對電場刺激誘發大鼠空腸平滑肌收縮反應的影響

100 μmol/L L-NAME或1 μmol/L新斯的明經浴槽內給藥，電場刺激實驗結果顯示，新斯的明能明顯增加電場刺激誘發正常及糖尿病大鼠空腸環形肌的收縮反應（P＜0.01，圖2A），而LNAME對電場刺激誘發的正常及糖尿病大鼠空腸環形肌收縮反應無明顯作用（P＞0.05，圖2B）；且新斯的明引起的糖尿病空腸環形肌收縮反應增加百分比明顯低于正常大鼠（P＜0.01，圖2C）。結果說明，與正常大鼠相比，糖尿病早期大鼠空腸的膽堿能神經功能受損，而氮能神經功能未見明顯變化。

2.3 空腸組織形態結構觀察

圖1 正常對照組大鼠和糖尿病模型組大鼠的體質量（A）和血糖濃度（B）比較Figure 1 Comparison of body weight (A) and blood glucose concentration (B) in normal and diabetic rats

圖2 新斯的明（A）和L-NAME（B）對電場刺激誘發大鼠空腸環形肌收縮反應的影響及其比較（C）Figure 2 Influence of neostigmine (A) and Nω-nitro-L- arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) (B) on electric field stimulation-induced contractile responses in jejunum circular muscle of rats and their comparison (C)

HE染色結果顯示，正常大鼠絨毛排列整齊（圖3A），絨毛結構完整（圖3B），空腸黏膜下層與黏膜肌層連接緊密（圖3C）；而糖尿病大鼠絨毛雜亂無序且較稀疏，有斷裂（圖3D～E），常見黏膜下層與黏膜肌層分離現象，且肌層增厚，杯狀細胞減少（圖3F）。

注：A和D、B和E、C和F圖中標尺大小分別為200、100、25μm。

2.4 空腸組織中乙酰膽堿轉移酶表達及絨腺比

免疫組織化學染色結果顯示，與陰性對照相比，目的蛋白的陽性表達顯示為褐色，且褐色越多越深表明蛋白表達越多。正常對照組大鼠空腸中，在黏膜肌間和黏膜下觀察到更多的褐色表達，即乙酰膽堿轉移酶表達較多（圖4A）；而糖尿病模型組大鼠則表達較少（圖4B）。結果表明，糖尿病早期大鼠空腸的膽堿能神經遞質合成減少。

HE染色后測量空腸內環肌和外縱肌的肌層厚度，計算絨腺比大小。與正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠的內環肌[（43.43±1.47）μmvs（22.90±1.59）μm]和外縱肌肌層厚度[（19.67±1.33）μmvs（12.89±0.60）μm]增加，絨腺比減小[（2.43±0.20）vs（3.67±0.53）]，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結果提示，糖尿病大鼠的空腸消化吸收功能減弱。

圖4 免疫組織化學法檢測兩組大鼠空腸組織中乙酰膽堿轉移酶的表達（DAB染色，×400）Figure 4 Expression of acetylcholine transferase in the jejunum of two groups of rats, as detected by immunohistochemistry (DAB staining, ×400)

3 討論

胃腸道被稱為“人體的母親河”，其在人體健康中的重要性越來越受到重視。糖尿病腸病的發病可能與內臟植物神經病變、電解質失衡、腸道激素分泌失調和胃腸功能障礙等因素有關[17-19]，但其與糖尿病的關系至今仍不甚清楚。病程較長的糖尿病患者的胃腸功能障礙癥狀明顯，但逆轉已形成的嚴重病變十分困難。為了探討糖尿病早期小腸的變化，本實驗室對STZ誘導4周的1型糖尿病大鼠小腸進行離體平滑肌電生理研究和組織形態學觀察，以期為疾病的早期預防和早期干預提供參考。

腸神經系統中，肌間神經叢主要調控腸運動功能。電場刺激誘發大鼠空腸的收縮反應可以被0.01 μmol/L TTX完全阻斷，表明觀察到的收縮反應為神經源性反應；另外，腸收縮反應也能被阿托品完全阻斷，提示引起收縮的興奮性神經遞質主要為ACh。乙酰膽堿轉移酶為ACh合成酶，而AChE為ACh水解酶，二者均與膽堿能神經功能直接相關；NOS為氮能神經遞質NO合成酶。有研究表明，電刺激可同時激活興奮性神經和抑制性神經，NOS抑制劑可引起興奮性神經釋放乙酰膽堿[20]。本實驗通過電場刺激誘發空腸平滑肌收縮反應，發現AChE抑制劑能使糖尿病大鼠反應降低，而NOS抑制劑未引起明顯改變。免疫組織化學實驗也表明，糖尿病大鼠空腸中乙酰膽堿轉移酶表達量減少。這些結果均提示，糖尿病大鼠空腸平滑肌的膽堿能神經受損，而氮能神經損傷滯后。候寧寧等[9]通過組織化學染色發現，STZ誘導后16周糖尿病大鼠小腸膽堿能神經元明顯減少；氮能神經元有減少趨勢，但差異無統計學意義。本研究提示，小腸膽堿能神經功能在STZ誘導糖尿病后4周時已發生明顯改變，而氮能神經受損可能發生在疾病較晚的時期。

有研究報道，硫化氫對大鼠腸缺血再灌注后離體回腸收縮活動的保護作用也主要是減輕腸神經，尤其是興奮性神經的損傷，表明大鼠腸神經中興奮性神經膽堿能神經為敏感神經[21]。另有一些研究顯示，在STZ引起的以及自發性糖尿病大鼠模型中，NO介導的不同部位的胃腸道平滑肌緩慢抑制性電位和機械性舒張受損；且外源性加入NO供體可恢復氮能神經功能，表明功能受損可能是節前神經NO合成減少所致[22-24]。其中，Xue等[22]利用細胞微電極技術研究STZ誘發后6周糖尿病大鼠模型，發現大鼠胃竇平滑肌的自發性活動電位受損，興奮性連接電位缺失，ACh誘導的膜去極化敏感性增強等，表明糖尿病引起神經肌肉傳遞功能損害，而這些平滑肌性質的改變可能與糖尿病引起的胃腸病變有關。而Cellek等[23]研究了不同病程（4、8、12、16和20周）的STZ糖尿病大鼠胃幽門神經元型NOS（neuronal NOS，nNOS）蛋白含量，發現隨著病程的發展，nNOS含量逐漸下降。但Chaudhury等[10]研究發現，STZ誘發后16周糖尿病大鼠空腸神經末梢肌球蛋白Va減少，而并非nNOS減少。由此可見，糖尿病胃腸道功能受損十分復雜，不同部位神經病變的情況不同，隨著病程的延長，神經病變會更加復雜且難以糾正，因此早期診斷和早期干預尤為重要。

本研究中HE染色后觀察空腸組織學形態，結果發現，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的空腸絨毛排列雜亂，有斷裂，絨腺比明顯降低，表明糖尿病大鼠空腸的消化吸收功能減弱，導致大鼠生長發育緩慢；這與糖尿病大鼠體質量增長緩慢的現象相符。觀察還發現，空腸黏膜與黏膜下層之間疏松結締組織出現較多裂隙，而該部位是黏膜下神經叢分布的區域，提示糖尿病大鼠空腸黏膜下神經叢功能可能受到影響。2018年有文獻報道，人類間質是在人體許多部位都廣泛存在的受到間歇性或節律性壓迫的組織，包括整個胃腸道和膀胱組織的黏膜下層、動脈周圍軟組織和筋膜等；并且這些流體豐富的解剖結構可能對腫瘤轉移、水腫、纖維化，以及許多或所有組織和器官的機械功能有重要作用[25]。

另外，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的空腸杯狀細胞數目減少，提示誘發后4周早期糖尿病大鼠的腸道黏膜屏障受損，可能有炎性反應發生[26]；而且糖尿病大鼠空腸各肌層厚度明顯增厚，提示可能與糖尿病大鼠的消化和吸收功能減弱，腸道發生代償性增厚而增強收縮，以彌補對營養物質吸收運化的不足有關。肌層厚度變化與神經調節改變之間有怎樣的關聯，本研究尚未能給出解釋，有待后續深入探討。

綜上所述，本研究發現在STZ誘發后4周的1型糖尿病早期大鼠模型中，空腸組織在神經功能和形態學上均發生明顯變化，提示腸道作為糖尿病敏感器官，對糖尿病的病程發展，以及早期發現和早期預防均有重要的臨床參考意義。