幾種常用免疫缺陷小鼠的血液學(xué)及血液淋巴細(xì)胞亞群的測定與比較分析

談小倩，瞿 偉，李 亮，錢 珍，顧堅(jiān)忠，徐 平

（上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，上海 201103）

免疫缺陷小鼠已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究。隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展、免疫缺陷機(jī)制研究的深入和重度免疫缺陷動(dòng)物研發(fā)的進(jìn)展，免疫缺陷動(dòng)物在研究中發(fā)揮越來越重要的作用[1]。臨床血液學(xué)、血清生化學(xué)指標(biāo)和淋巴細(xì)胞亞群分析不僅對免疫缺陷動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制、正常生理狀態(tài)的判定以及動(dòng)物飼養(yǎng)管理有指導(dǎo)意義，而且也是相關(guān)醫(yī)學(xué)研究，尤其是人的免疫系統(tǒng)重建、腫瘤組織及骨髓細(xì)胞移植、干細(xì)胞研究，以及抗腫瘤藥物研發(fā)和安全性評價(jià)等應(yīng)用中的重要參考指標(biāo)和依據(jù)。本研究旨在通過測定、分析常用的幾種免疫缺陷動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)和淋巴細(xì)胞亞群，為不同免疫缺陷小鼠在醫(yī)學(xué)研究中的恰當(dāng)選擇、應(yīng)用和比較醫(yī)學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級近交系BALB/cA小鼠（作為對照）和4種免疫缺陷型BALB/cA-nude（BALB/cAShjhnu/nu）、SCID（C.B17/Icr-Prkdcscid/scid/Shjh）、NOD-SCID（NOD.CB17/Icr-Prkdcscid/scid/Shjh）、NPSG（NOD-PrkdcscidIL-2γ gnull）小鼠，由上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司提供[SCXK（滬）2017-0012]。飼養(yǎng)環(huán)境為隔離器環(huán)境，溫度20～24 ℃，相對濕度50%±10%，12 h明暗交替光照，飼喂上海吉輝JH-M01配方全價(jià)飼料（60Co輻照處理，輻照劑量為35 kGy）；飲用水為滅菌過濾水（121℃，30min高壓滅菌），自由采食和飲水。

1.2 主要儀器和試劑

Sysmex XT-2000i全自動(dòng)血液分析儀，購自希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司，使用配套試劑測定血常規(guī)；Hitachi 7180型自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒，購自日本日立公司；BD FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀及配套試劑，購自美國BD公司。

1.3 臨床血液學(xué)、血清生化學(xué)指標(biāo)測定

5種品系的6周齡小鼠各20只（雌雄各半），禁食16 h后小鼠眼眶采血800 μL/只。取150 μL全血加入EDTA-K2抗凝測血常規(guī)。650 μL血液靜置30 min后放入離心機(jī)，以10000 r/min離心2 min，取血清用于生化指標(biāo)測定。

1.3.1 血常規(guī)測定

采用全自動(dòng)血液分析儀檢測白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均壓積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板（PLT）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度差異（RDW-CV）、血小板體積分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、大型血小板比率（P-LCR）、血小板壓積（PCT）、中性粒細(xì)胞數(shù)（NEUT）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYMPH）、單核細(xì)胞數(shù)（MONO）、嗜酸性細(xì)胞數(shù)（EO）、嗜堿性細(xì)胞數(shù)（BASO）、中性粒細(xì)胞百分率（NEUT%）、淋巴細(xì)胞百分率（LYMPH%）、單核細(xì)胞百分率（MONO%）、嗜酸性細(xì)胞百分率（EO%）、嗜堿性細(xì)胞百分率（BASO%）、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)（RET）、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率（RET%）、低分化網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率（LFR）、中分化網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率（MFR）、高分化網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率（HFR）、未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞（IRF）等30項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 血清生化學(xué)檢測

采用自動(dòng)生化分析儀檢測血清生化指標(biāo)：包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白球蛋白比（A/G）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（Urea）、肌酐（Crea）、尿酸（UA）、鈣（Ca）、磷（P）、總膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）、血清膽堿酯酶（CHE）、游離脂肪酸（NEFA）等25項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 血液淋巴細(xì)胞亞群分析

6周齡小鼠各2只，采血后用流式細(xì)胞儀分析各品系小鼠CD45+、CD11b+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK1.1、B220等淋巴細(xì)胞亞群的含量。通過設(shè)門的方式，讀取其含量，并與近交系BALB/cA小鼠進(jìn)行比對。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床血液學(xué)指標(biāo)比較

表1 幾種免疫缺陷小鼠血液學(xué)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of hematological indexes among immunodeficient mice

從表1可見，4種免疫缺陷小鼠的WBC、LYMPH、LYMPH%和NEUT水平均明顯低于BALB/cA小鼠（P＜0.05或P＜0.01），NEUT%、RET、RET%和HFR則高于BALB/cA小鼠（P＜0.05或P＜0.01）；另外，免疫缺陷小鼠的PLT也相對偏高，LFR偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與BALB/cA-nude小鼠相比，SCID、NOD-SCID和NPSG小鼠的WBC、LYMPH、LYMPH%、NEUT%變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與SCID小鼠相比，NOD-SCID和NPSG小鼠的LYMPH變化明顯（P＜0.05或P＜0.01）；而NOD-SCID和NPSG小鼠相比，LYMPH、LYMPH%和NEUT%存在差異（P＜0.05）。

2.2 血清生化學(xué)指標(biāo)比較

從表2可見，NOD-SCID和NPSG小鼠的AST水平稍高于BALB/cA小鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；4種免疫缺陷小鼠的TG水平明顯低于BALB/cA小鼠（P＜0.01）；NOD-SCID和NPSG小鼠的GLU水平低于BALB/cA小鼠（P＜0.05），UA水平則高于BALB/cA小鼠（P＜0.05）；與BALB/cA-nude小鼠相比，SCID和NPSG小鼠的UA水平變化明顯（P＜0.05）；與SCID小鼠相比，NOD-SCID和NPSG小鼠的UA水平明顯降低（P＜0.05）；與NOD-SCID小鼠相比，NPSG小鼠的UA水平明顯降低（P＜0.05）。NOD-SCID和NPSG小鼠的CK、LDH水平明顯高于BALB/cA、BALB/cA-nude和SCID小鼠（P＜0.05）。

表2 幾種免疫缺陷小鼠血清生化學(xué)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of biochemical parameters among immunodeficient mice

2.3 淋巴細(xì)胞亞群分析

從表3可見， BALB/cA小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞發(fā)育正常。BALB/cAnude小鼠T細(xì)胞缺失（CD3+CD4+和CD3+CD8+占比均為0%）、NK細(xì)胞活性降低；SCID小鼠T細(xì)胞缺失，B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性低下；NODSCID小鼠T細(xì)胞缺失，B細(xì)胞（B220占比0.2%）和NK細(xì)胞（NK1.1占比0.1%）幾乎無活性；NPSG小鼠T細(xì)胞缺失，B細(xì)胞和NK細(xì)胞也幾乎無活性。

表3 幾種免疫缺陷小鼠和BALB/cA小鼠的淋巴細(xì)胞亞群Table 3 Lymphocyte subsets in immunodeficient mice and BALB/cA inbred mice (%)

3 討論

免疫缺陷動(dòng)物本身的研究發(fā)展經(jīng)歷了漫長而復(fù)雜的過程。從20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)無毛小鼠表型[1]，到發(fā)現(xiàn)胸腺發(fā)育不全，再到目前一些重度免疫缺陷小鼠的構(gòu)建，免疫缺陷動(dòng)物的發(fā)展史本身就是科學(xué)研究進(jìn)步的縮影。由于缺失正常的免疫功能[2]，免疫缺陷小鼠容易受到外界病原體的感染，在較高程度上接受外來移植物，在免疫、感染、腫瘤和干細(xì)胞研究中有很高的應(yīng)用價(jià)值。裸小鼠由于Foxn1nu基因純合，導(dǎo)致小鼠的毛桿不能從表皮中長出，出現(xiàn)無毛表型，同時(shí)導(dǎo)致胸腺發(fā)育不良，T細(xì)胞缺失；它是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，由于第Ⅷ連鎖群內(nèi)無毛位點(diǎn)基因發(fā)生純合而形成的突變小鼠[3]，特別是在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面有著特殊的價(jià)值。由于nu基因有獨(dú)特的遺傳特性，經(jīng)過世界各國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)家的努力，已將nu基因?qū)氩煌幌祫?dòng)物，成為系列動(dòng)物模型。由于它們具有不同的遺傳背景和nu基因的遺傳特性，使醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究者獲得了一種極其寶貴的試驗(yàn)材料。SCID小鼠是Prkdc基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，無法產(chǎn)生功能正常的抗原受體蛋白[4]，導(dǎo)致B細(xì)胞和T細(xì)胞功能缺失，因而可以廣泛應(yīng)用于人類免疫學(xué)和病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)等方面研究及單克隆抗體的制備等[5]。然而并非所有SCID小鼠都缺乏功能性淋巴細(xì)胞，有2%～23%的個(gè)體具有有限數(shù)量的T細(xì)胞和B細(xì)胞，并可恢復(fù)部分免疫功能，即所謂的SCID小鼠滲漏現(xiàn)象[6]。而用血糖代謝異常、存在包括NK細(xì)胞功能和補(bǔ)體（C5）功能在內(nèi)的多種免疫缺陷的NOD小鼠與SCID小鼠雜交后，再連續(xù)用NOD小鼠回交（10代以上）后得到scid突變純合的同源導(dǎo)入近交系（congenic inbreed strain）NODSCID小鼠[7]，Prkdc位點(diǎn)缺失，T細(xì)胞和B細(xì)胞缺失，NK細(xì)胞功能缺陷，還具有支持更高水平人體造血細(xì)胞植入的能力，成為人源化小鼠的一個(gè)很好的模型，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于同種和異種腫瘤移植、血液學(xué)研究、免疫學(xué)及炎癥研究，以及糖尿病和肥胖研究等[8]。人源化小鼠經(jīng)歷了40多年的發(fā)展，現(xiàn)已經(jīng)在諸如造血功能、感染性疾病、自身免疫病以及腫瘤學(xué)研究[9]等多領(lǐng)域顯現(xiàn)出其獨(dú)特作用，顯示出用于體內(nèi)研究人類生理及病理的優(yōu)勢。NPSG小鼠以NOD近交系小鼠為背景，在Prkdc基因上進(jìn)行點(diǎn)突變，制成重度聯(lián)合免疫缺陷的NOD-SCID小鼠（T、B淋巴細(xì)胞和部分NK細(xì)胞都有缺陷），在此基礎(chǔ)上再將具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的IL2受體的γ 鏈基因敲除，使得NK細(xì)胞也基本失去功能，同時(shí)造成部分免疫因子（白細(xì)胞介素、補(bǔ)體等）功能缺陷，是人源化研究的重要模型之一。

本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物均飼養(yǎng)在隔離器環(huán)境，自由采食飲水，飼料一致，飼養(yǎng)人員穩(wěn)定，環(huán)境可控。因此，所測試的動(dòng)物血液常規(guī)、血生化以及血液淋巴細(xì)胞亞群分析數(shù)據(jù)均能體現(xiàn)其自然狀態(tài)下的正常情況，而不同品系動(dòng)物因?yàn)槊庖呷毕莩潭炔煌嬖谥承┡c免疫力相關(guān)指標(biāo)的差異。從血常規(guī)指標(biāo)測定分析結(jié)果可以看出，免疫缺陷動(dòng)物的WBC極顯著低于正常動(dòng)物，而SCID、NOD-SCID、NPSG小鼠的WBC顯著低于BALB/cA-nude（P＜0.05）；由此可見，上述指標(biāo)與免疫缺陷程度有關(guān)，免疫缺陷程度越高，WBC越低。白細(xì)胞五分類中，免疫缺陷小鼠的LYMPH、LYMPH%和NEUT也顯著低于BALB/cA小鼠（P＜0.05或P＜0.01）；而NEUT%、RET%和RET則明顯高于BALB/cA小鼠（P＜0.01）。

血清生化分析發(fā)現(xiàn)，免疫缺陷與免疫正常的動(dòng)物除GLU、TG、UA、CK和LDH外，其他指標(biāo)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與免疫缺陷程度無關(guān)。流式細(xì)胞分析結(jié)果驗(yàn)證免疫缺陷動(dòng)物的血液淋巴細(xì)胞亞群的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)：裸小鼠的T細(xì)胞缺失，NK細(xì)胞活性降低；SCID小鼠的T細(xì)胞缺失，B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性下降；NOD-SCID小鼠的T、B細(xì)胞缺失，NK細(xì)胞活性低下；而NPSG小鼠除T、B細(xì)胞缺失外，NK細(xì)胞幾乎無活性。另外，根據(jù)本公司對外提供的小鼠生長發(fā)育數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，同周齡BALB/cA小鼠體質(zhì)量高于NOD-SCID、NPSG小鼠[8]。

本研究分析了幾種常見免疫缺陷小鼠的血液生理、血清生化和血液淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)數(shù)據(jù)，后續(xù)將對這些品系小鼠的血清免疫學(xué)以及臟器等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行持續(xù)性測試和比較分析，形成各品系的系統(tǒng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為科學(xué)研究提供支撐保障。