樹鼩脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及EV71感染實驗

施梅言，王 璇，王文廣，阮蕾穎，代解杰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，昆明 650118）

71型腸道病毒（enterovirus 71，EV71）是小核糖核酸家族的一員，由無包膜單鏈RNA病毒組成。EV71能侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。越來越多的證據(jù)表明，EV71可直接感染神經(jīng)元，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫反應(yīng)在限制病原體感染中發(fā)揮重要作用[1]。但是EV71感染中樞神經(jīng)的致病機制尚不明確。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血-脊髓屏障與血-腦屏障的主要成分，與其他類型的細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞或周細(xì)胞一起，通過緊密連接的方式形成神經(jīng)血管單位[2]，專門調(diào)節(jié)體液、分子和細(xì)胞在外周血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的交換。脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞（spinal cord microvascular endothelial cells，SCMECs）與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相似，也參與了許多與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理過程[3]，是血-脊髓屏障的重要組成部分。在脊髓損傷和實驗性自身免疫性腦脊髓炎中，內(nèi)皮細(xì)胞通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞浸潤、病理性血管生成和纖維化，發(fā)揮了髓鞘清除之外的重要功能，從而促進脫髓鞘疾病的進展[4]。推測EV71可能通過血液跨越血-脊髓屏障引起脊髓內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但其相關(guān)機制的研究需要建立血-脊髓屏障感染細(xì)胞模型。

樹鼩是一種新型的實驗動物，已廣泛應(yīng)用于人類疾病模型的研究，包括病毒感染模型、腫瘤模型、呼吸系統(tǒng)疾病模型和神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型等[5]。例如Tong等[6]利用慢病毒感染，成功地在樹鼩中生成了惡性膠質(zhì)瘤；與相應(yīng)的小鼠膠質(zhì)瘤相比，樹鼩膠質(zhì)瘤在基因表達譜上與人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤更為相似。王文廣等[7]發(fā)現(xiàn)EV71能感染幼齡中緬樹鼩，并建立了樹鼩EV71手足口病的疾病動物模型。本研究在此基礎(chǔ)上探索一種操作簡便、經(jīng)濟可行的原代SCMECs分離培養(yǎng)方法，并用EV71感染樹鼩SCMECs，初步探究EV71的感染性及增殖活性，為利用樹鼩開展EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病機制研究提供重要的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與病毒

取1只3月齡的雄性滇西亞種中緬樹鼩（Tupaia BelangeriChinensis），由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滇）K2018-0002，使用許可證號為SYXK（滇）K2018-0002。本研究遵循實驗動物使用的3R和福利倫理原則。

EV71標(biāo)準(zhǔn)毒株（FY-23-KB株）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室分離饋贈。非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心保存。

1.2 主要儀器與試劑

生物安全柜和CO2恒溫培養(yǎng)箱均購自美國Forma公司。臺式高速冷凍離心機購自美國Beckman公司。ECLIPSE Ti倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。D-Hank’s液、DNaseⅠ、HEPE緩沖液和Ⅱ型膠原酶購自北京索萊寶科技有限公司。分散酶和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Sigma公司。嘌呤霉素和胰島素鐵硒轉(zhuǎn)運蛋白（insulin-transferrin-selenium，ITS）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）均購自美國PeproTech公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25% Trypsin-EDTA、DMEM/F12培養(yǎng)液和雙抗（青鏈霉素混合液）均購自美國HyClone公司。鼠源性抗CD31單克隆抗體、兔源性抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）單克隆抗體、熒光標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG購自英國Abcam公司。兔源性抗EV71抗體購自美國GeneTex公司。CCK-8購自日本Dojindo公司。一步法熒光定量PCR試劑盒OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司，病毒RNA提取試劑盒QIAamp?Viral RNA Mini Kit購自德國Qiagen公司，熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 樹鼩SCMECs的分離

本實驗借鑒苑曉晨等[8]的分離方法，并做了一些改進。取3月齡左右的樹鼩，行安死術(shù)（腹腔注射3%的戊巴比妥0.4 mL）處死后，迅速取出整段脊柱，浸入75%的乙醇溶液中消毒3 min，無菌PBS漂洗3次。無菌操作取出中段脊髓組織，在體視鏡下去除脊膜和血管，用D-Hank’s漂洗3次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，加入1mL DMEM/F12培養(yǎng)液。將脊髓組織剪為1 mm3的小塊，分別加入Ⅱ型膠原酶（2mg/mL）和DNaseⅠ（60 U/mL）各2 mL，37 ℃消化1 h，每15 min輕搖混勻一次。將消化液轉(zhuǎn)至15 mL離心管中，4 ℃ 207×g離心8 min，棄上清液。用22% BSADMEM/F12培養(yǎng)液重懸后，4 ℃下824×g離心20min，棄上清液。加入Ⅱ型膠原酶（2mg/mL）、分散酶（2mg/mL）和DNaseⅠ（60 U/mL）各1 mL，混勻后37 ℃消化30 min。室溫下207×g離心8min，棄上清液后獲得微血管片段，用DMEM/F12培養(yǎng)液漂洗，再207×g離心8 min，棄上清液，重復(fù)3次。用DMEM/F12培養(yǎng)液（含20% FBS、1% ITS、10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1%雙抗和1% HEPE緩沖液）重懸后，接種于T25培養(yǎng)瓶中，72h后換液，之后每隔1d換液一次。

1.4 SCMECs的純化

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿瓶底后，用0.25%的Trypsin-EDTA消化傳代2次。待細(xì)胞鋪滿瓶底的70%，換用含嘌呤霉素（5 ng/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)9～12 h。去除培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，用不含嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿瓶底。然后用0.25% Trypsin-EDTA消化傳代，重復(fù)純化3次。

1.5 SCMECs的形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定

取不同培養(yǎng)時期的SCMECs，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并拍照。

將純化后第3代的細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞長滿80%左右，用PBS浸洗3次，每次2～3 min；用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定10 min，PBS漂洗3次，每次2～3 min；用體積分?jǐn)?shù)為5%的山羊血清封閉30 min；棄山羊血清，PBS漂洗3次，每次2～3 min；分別在不同的孔板中滴加稀釋好的鼠源性抗CD31一抗（工作液稀釋比例為1∶400）和兔源性抗vWF一抗（1∶400），對照孔加PBS代替，4℃過夜孵育；PBS漂洗3次，每次2～3 min；分別滴加羊抗鼠、羊抗兔熒光二抗（1∶400），37℃孵育1 h；PBS漂洗3次，每次2～3 min；DAPI染核2 min，PBS漂洗3次，每次2～3 min；加入抗熒光淬滅劑（1∶500），在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 CCK-8法測定細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞純化培養(yǎng)后，將單層生長的細(xì)胞用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，并稀釋至5×104個細(xì)胞/mL。每孔接種100 μL細(xì)胞液于96孔板，設(shè)1～8 d共8組，每組3個實驗孔、3個空白調(diào)零孔；其中空白調(diào)零孔不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，分別在第1、2、3、4、5、6、7、8d吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含CCK-8試劑的混合培養(yǎng)液（90 μL培養(yǎng)液、10μL CCK-8試劑），繼續(xù)培養(yǎng)30 min。選擇波長450 nm，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度（A值）。

1.7 EV71滴度的測定

病毒樣品用含2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液連續(xù)10倍梯度稀釋，將稀釋好的病毒液加入含Vero細(xì)胞的96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察8 d。使用病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）檢測病毒滴度，在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）情況，用 Karper法計算病毒的滴度。

1.8 EV71感染細(xì)胞與病毒增殖活性的測定

用滴度為3.2×106TCID50/mL的EV71，以最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為1感染SCMECs。待病毒吸附1.5 h后，PBS洗去未吸附的病毒，加入含2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液1 mL，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染0、12、24、36、48、72、96h收集樣品，檢測病毒載量。

采用QIAamp?Viral RNA Mini Kit，提取上述收集到的病毒感染后細(xì)胞樣品中的RNA。使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，采用TaqMan熒光定量PCR法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞中的病毒載量。EV71上游引物序列為5'-CAGTCATCGATTGGATAC-3'，下游引物序列為5'-CTCTGCTGAAGAAACTATC-3'，熒光探針序列為5'-FAMCAAGGTTCCAGCACTCCAAGC-BHQ1-3'。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，45個循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度來計算上清液和細(xì)胞中的病毒載量。

1.9 EV71感染細(xì)胞后的間接免疫熒光觀察

取純化后的SCMECs，接種病毒感染12 h后，參照1.5節(jié)的方法進行免疫熒光實驗；其中一抗為兔源性抗EV71抗體（工作液稀釋比例為1∶1000），二抗為羊抗兔熒光二抗（1∶400）。反應(yīng)結(jié)束后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各實驗均獨立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示。多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩SCMECs形態(tài)學(xué)觀察

在顯微鏡下可見，原代培養(yǎng)24 h的樹鼩脊髓微血管片段主要呈現(xiàn)分支狀和串珠狀（圖1A）；72 h后有細(xì)胞從微血管段中爬出，呈現(xiàn)多角狀和不規(guī)則形態(tài)（圖1B）；培養(yǎng)至第5天，細(xì)胞逐漸鋪滿瓶底，大部分呈“鋪路石”狀（圖1C）。加入嘌呤霉素（5 ng/mL）進行細(xì)胞純化時，可觀察到雜細(xì)胞脫落死亡；嘌呤霉素處理9 h左右，大部分雜細(xì)胞已經(jīng)脫落死亡（圖2A、2B）；而經(jīng)嘌呤霉素純化培養(yǎng)后的細(xì)胞主要是不規(guī)則的多角狀細(xì)胞（圖2C）。

圖1 樹鼩原代脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞Figure 1 Primary cultured spinal cord microvascular endothelial cells derived from tree shrews

2.2 樹鼩SCMECs細(xì)胞免疫熒光鑒定

CD31（又稱為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1）和vWF（又稱為Ⅷ因子相關(guān)抗原）在主要的器官和血管內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達，可作為鑒定微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白。使用抗CD31和抗vWF抗體對純化培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示CD31陽性細(xì)胞激發(fā)紅色熒光，vWF陽性細(xì)胞激發(fā)綠色熒光，細(xì)胞核為藍色（圖3），證明純化的細(xì)胞為SCMECs。

2.3 SCMECs的生長曲線

根據(jù)細(xì)胞生長每天測得的A450nm，取平均值，繪制細(xì)胞生長曲線（圖4A）。統(tǒng)計分析顯示，SCMECs在第2天、第3天生長較快，第3天時已長滿培養(yǎng)瓶底部；在1～3 d細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞處于對數(shù)生長期；4d后，細(xì)胞增殖變緩，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞增殖的速度先加快后降低（P＜0.05）。

圖2 純化后的樹鼩脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞Figure 2 Tree shrew spinal cord microvascular endothelial cells after puromycin purification

圖3 樹鼩脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31和vWF的免疫熒光染色結(jié)果Figure 3 Immunofluorescence staining of CD31 and vWF in spinal cord microvascular endothelial cells isolated from tree shrews

2.4 EV71感染樹鼩SCMECs的病毒增殖曲線

檢測不同時間點的病毒載量，繪制病毒增殖曲線（圖4B）。結(jié)果顯示，EV71感染SCMECs 48 h內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒載量呈線性上升的趨勢，且在感染48 h達到頂峰（P＜0.05），48 h后緩慢降低；細(xì)胞中的病毒載量在12 h達到頂峰，12 h后病毒載量逐漸降低，且在24 h發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始死亡，96 h時細(xì)胞已完全脫落死亡（P＜0.05）。這一結(jié)果初步說明EV71能感染SCMECs，并在細(xì)胞內(nèi)有效增殖。

2.5 EV71感染細(xì)胞后的免疫熒光觀察

將EV71感染純化后的SCMECs 12 h后，使用兔源性抗EV71抗體進行間接免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，EV71感染的細(xì)胞可見紅色熒光，且大部分紅色熒光都圍繞在細(xì)胞核周圍。這一結(jié)果進一步說明，EV71能感染SCMECs，且EV71顆粒主要分布于被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖5）。

圖4 樹鼩脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線（A）和EV71感染后的病毒增殖曲線（B）Figure 4 Growth curve of spinal cord microvascular endothelial cells (SCMECs) (A) and the proliferation curve of enterovirus 71(EV71) in EV71-infected SCMECs of tree shrew (B)

圖5 EV71感染后脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的免疫熒光觀察Figure 5 Immunofluorescence staining in microvascular endothelial cells infected with enterovirus 71 (EV71)

3 討論

EV71是一種嗜神經(jīng)性病毒，能夠引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，使患者出現(xiàn)明顯的臨床綜合征；研究發(fā)現(xiàn)，病毒主要集中在患者的脊髓和腦干[9]。然而，EV71感染的確切發(fā)病機制，特別是引起嚴(yán)重神經(jīng)癥狀的機制，尚不清楚。SCMECs是構(gòu)成血-脊髓屏障的重要細(xì)胞成分，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理過程都與SCMECs相關(guān)，包括創(chuàng)傷、缺血、輻射、感染和炎性反應(yīng)等[10-12]。本實驗采用樹鼩的SCMECs進行EV71體外感染特性的研究，以期為探討EV71致病機制提供新的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

目前，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)主要來源于動物的腦組織，而鮮有脊髓來源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的文獻報告。本實驗主要采用苑曉晨等[8]報告的SCMECs培養(yǎng)方法，并做了以下改良：（1）借鑒部分學(xué)者選用4～6周小鼠的研究經(jīng)驗[13]，本實驗采用3月齡樹鼩的脊髓中段組織分離微血管內(nèi)皮細(xì)胞，此年齡段樹鼩的脊膜和血管容易分離，后期培養(yǎng)時不易混入成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞；且我們的預(yù)實驗表明，相比于使用1～2周的樹鼩，使用3月齡樹鼩進行細(xì)胞分離獲得的微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度更高，數(shù)量更多。（2）借鑒Browning等[14]培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞時采用MEM培養(yǎng)液的經(jīng)驗，本實驗采用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液并補充生長因子，成本更低，且細(xì)胞增殖快，活性高。本研究分離的原代細(xì)胞在第3代完成純化，該細(xì)胞分離培養(yǎng)能持續(xù)13代，且能傳代培養(yǎng)，滿足本次實驗要求。第14代時，細(xì)胞增殖緩慢，活性降低。另外，據(jù)報告，Wang等[15]和苑曉晨等[8]分別采用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31及vWF進行免疫熒光染色鑒定；本實驗也采用這兩種特異性標(biāo)志物進行熒光染色以鑒定樹鼩微血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示分離的細(xì)胞均能被熒光標(biāo)記，此結(jié)果與之前文獻報告一致。細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)1～3 d時，細(xì)胞快速增殖進入對數(shù)期；3～4d后達到平臺期，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，提示分離的SCMECs能夠充分滿足體外EV71感染實驗的要求。

馬娜[16]用EV71感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要細(xì)胞＿ ＿ 星形膠質(zhì)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)感染6～8 h時病毒滴度達到峰值，然后隨細(xì)胞破壞的增多而逐漸下降。本研究用EV71感染樹鼩SCMECs后，分別檢測不同時間點細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液中的病毒載量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中病毒載量在12 h到達頂峰后逐漸降低，與EV71感染星型膠質(zhì)細(xì)胞的病毒增殖動力曲線相似，表明EV71能在SCMECs中有效復(fù)制、增殖。為進一步確定EV71的感染情況，本研究用間接免疫熒光法檢測EV71顆粒的定位情況，結(jié)果在感染12 h后能明顯檢測到紅色熒光，且主要圍繞在細(xì)胞核周圍，表明EV71顆粒主要分布于被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。一般認(rèn)為，病毒能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制即表明病毒培養(yǎng)成功。因此，以上結(jié)果證明EV71可感染SCMECs，提示SCMECs有望成為研究EV71感染的體外細(xì)胞模型。

綜上所述，本研究成功分離了樹鼩原代SCMECs并優(yōu)化培養(yǎng)條件，通過嘌呤霉素純化結(jié)合自然傳代的方法得到較純且生長狀態(tài)良好的SCMECs；并且在體外用EV71感染SCMECs后，定量檢測細(xì)胞中病毒增殖情況，免疫熒光法鑒定病毒蛋白表達，結(jié)果證明EV71可成功感染SCMECs。這些結(jié)果為今后進行體外血-脊髓屏障功能及相關(guān)研究奠定了一定基礎(chǔ)，也為利用樹鼩進行EV71體內(nèi)感染模型的研究提供了理論支持。