免疫功能正常的HBV cccDNA小鼠模型用于苦參堿和青蒿素抑制HBV的藥效評價

伍 悅，呂小琴，劉 陽, ，向 霞，趙中華，徐如青，潘朔寒，何明忠，張華堂，賴國旗

（1. 重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶 400010；2. 重慶醫科大學實驗動物中心，重慶 400016；3. 瀘縣第二中學，瀘州 646106；4. 重慶市科學技術研究院，重慶 401123）

近年來，90%以上的丙肝患者能夠實現臨床治愈，但乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染仍是一個困擾全球的健康問題。雖然自1982年預防性HBV疫苗應用以來，兒童的HBV感染率顯著下降，但是世界衛生組織數據顯示全球仍有約2.5億人為慢性乙型肝炎（簡稱乙肝）患者。中國是全球慢性乙肝中高度流行地區，據統計中國慢性乙肝發病人數約930萬，其中約10%～20%會發展成為肝硬化，1%～5%可演變成為肝細胞癌[1-2]。消滅HBV或已成為全球實現“2030全面消滅病毒性肝炎目標”的頭等大事[3-4]，也是中國醫療衛生事業面臨的一個重大挑戰[5]。目前，乙肝防控仍存在不少難點，其中，缺乏合適的實驗動物模型一直是HBV研究領域中病毒學、免疫學和新藥評價研究的瓶頸。

CBA/CaJ小鼠的B細胞、T細胞、自然殺傷細胞和粒細胞均正常[6]。與BALB/cJ、C57BL/6J和C3H/HeN等6個品系小鼠相比，HBV感染CBA/CaJ小鼠的效率不受鼠齡的影響，同時，病毒攜帶時限可以超過半年以上[7]。本課題組前期利用分子生物學技術體外合成HBV共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），并通過尾靜脈高壓水動力注射至CBA/CaJ小鼠體內，自主研發建立了免疫功能正常的HBV cccDNA小鼠模型[8-10]。盡管已經證明這一模型具有建模方便、免疫健全、攜帶病毒時限超過半年，且肝細胞中含有HBV cccDNA等優點[11-14]，但是該模型是否能很好地用于藥物評價尚不清楚。

中藥是我國醫學瑰寶。已有文獻報道，中藥苦參堿（matrine）及青蒿素（artemisinin）在體外及體內均具有一定的抑制HBV的作用[11]，但因無理想的動物模型，其藥效評價指標有限。本研究應用HBV cccDNA CBA/CaJ小鼠模型，觀察苦參堿和青蒿素對模型小鼠體內HBV的治療作用，并以此評價該小鼠模型的應用價值，為應用該模型進行藥效學評價研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級的8～10周齡雄性CBA/CaJ小鼠37只，體質量為22～25 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心[SCXK（渝）2018-003]。動物實驗操作在重慶醫科大學實驗動物中心屏障設施內完成，實驗動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-003。本實驗方案得到重慶醫科大學倫理委員會的批準（No.2015019）。

1.2 藥品與主要試劑

苦參堿（批號：CAS#519-02-8）購自上海源葉生物科技有限公司；青蒿素（批號：CAS#63968-64-9）購自北京索萊寶科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（批號：Cat.#DP315）購自天根生化科技（北京）有限公司；HBV表面抗原（HBV surface antigen，HBsAg）診斷試劑盒（國藥準字S10910113）購自上海科華生物工程股份有限公司；HBsAg質控標準品[批號：GBW(E)090072]購自北京康徹思坦生物技術有限公司；馬抗HBsAg多克隆抗體（ab9193）（批號：Lot. GR207325-21）和山羊抗兔IgG H&L（ab6717）（批號：A20180314314）購自英國Abcam公司；兔抗HBV核心抗原（HBV coreantigen，HBcAg）抗體（GTX40523）（批號：Lot No.82180026）購自美國GeneTex公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗馬多克隆抗體（批號：SAA544Eq09）購自美國Cloud-Clone Crop公司；T5核酸外切酶試劑盒（批號：M0363S）購自新英格蘭生物（北京）有限公司；Blaze iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix試劑盒（批號：Cat.#1725124）購自美國Bio-Rad公司。定量PCR檢測引物均由重慶茂百科技有限公司合成。

1.3 實驗儀器

酶標檢測儀（1510-00783）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；核酸濃度檢測儀（NanoDrop 2000）購自香港基因有限公司；CFX ConnectTMReal-Time System定量PCR檢測儀（788BR05039）購自美國Bio-Rad公司。

1.4 藥物配制

苦參堿和青蒿素分別用二甲基亞砜溶解為無色透明的儲存液（250 μg/μL），于－80℃保存。使用時按如下體積比配制藥物使用質量濃度（5μg/μL）：2%藥物儲存液，40%聚乙二醇300，2%吐溫80，最后用ddH2O補足至2 mL；依次加入溶劑，每加入一種溶劑后，先充分振蕩混勻，再加入下一種溶劑。

1.5 動物模型的建立與鑒定

按照本課題組之前建立的方法[8-10]制備HBV cccDNA，然后從尾靜脈一次性高壓注射質量濃度為1 μg /mL的HBV cccDNA于每只CBA/CaJ小鼠中，注射量為小鼠體質量的8%（約2mL），注射時間控制在6～8 s。高壓注射后第1周和第8周分別采集小鼠血清，按照HBV表面抗原診斷試劑盒說明檢測血清中HBsAg含量，并判斷HBsAg陽性結果。第1周血清HBsAg陽性者（樣本光密度值與陰性對照孔平均光密度值+0.100的比值≥1.0），初步判斷為HBV小鼠感染成功；第8周檢測血清HBsAg陽性，同時HBV DNA載量大于105拷貝/mL者，判斷為HBV cccDNA模型陽性，并用于后續的藥物評價研究。

1.6 藥物實驗

成功轉染HBV cccDNA后第8周（處于急性期）和第26周（處于慢性期）的小鼠分別隨機分為苦參堿組、青蒿素組和生理鹽水對照組。每組小鼠6只，按小鼠體質量分別腹腔注射50 μg/g苦參堿、50 μg/g青蒿素或同體積的0.9%氯化鈉溶液（此時記為給藥第0周），每3d給藥1次，連續給藥9次，共27d（約4周）。給藥過程中定期進行尾靜脈采血，急性期小鼠的具體采血時間點為給藥前和開始給藥后第1、2、3、4周，慢性期小鼠的采血時間點為給藥前和開始給藥后第2、4周。在最后一次收集血清后，急性期和慢性期所有小鼠經麻醉后以脫頸椎法無痛處死，收集肝組織。

1.7 實時定量PCR法檢測HBV DNA和HBV cccDNA

用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取小鼠血清或肝組織中HBV總DNA。使用CFX ConnectTMReal-Time System定量PCR檢測儀和Blaze iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix試劑盒進行HBV DNA和HBV cccDNA的定量PCR檢測。HBV DNA的上游引物（1493）序列為5'-TTCTCCGCCTGTCGTACC-3'，下游引物（1638）序列為5'-GGTTTCTGTGGGCGTTCC-3'；HBV cccDNA的上游引物（1559）序列為5'-CTTCTCATCTGCCGGACC-3'，下游引物（1864）序列為5'-CACAGCTTGGAGGCTTGA-3' 。

在進行HBV cccDNA熒光定量PCR檢測之前，用核酸外切酶T5處理樣品，去除線性和有缺口的DNA，僅保留cccDNA，以避免細胞基因組、HBV rcDNA對cccDNA的影響，使定量檢測結果更加準確。按照T5核酸外切酶試劑盒說明書，37 ℃處理1 h后，再72 ℃ 20 min，酶切結束后的產物置于－20 ℃保存備用。定量檢測HBV DNA和cccDNA的PCR擴增條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸5 min，并讀取熔解曲線。定量PCR檢測時使用合成的已知拷貝數的標準品（5×108拷貝）以繪制標準曲線，檢測得到樣本的HBV DNA或cccDNA拷貝數，然后統計學分析兩個藥物組與生理鹽水對照組的差異。

1.8 酶聯免疫吸附法檢測血清中HBsAg水平

按照HBV表面抗原診斷試劑盒操作說明書步驟，采用酶聯免疫吸附法檢測用藥后各組小鼠血清中HBsAg的水平。檢測有效值的判斷標準：陰性對照孔平均光密度值NCx≤0.01，陽性對照孔平均光密度值≥1，判斷為檢測操作有效無誤；樣本光密度值與COV值（COV=NCx+0.100）的比值≥1.0，判斷為樣本HBsAg陽性。樣本HBsAg表達量的計算：用HBsAg標準質控品建立的標準曲線，按照樣本光密度值和HBsAg標準曲線得到的公式計算HBsAg含量；HBsAg標準質控品的含量為4 U/mL，樣本HBsAg檢測時對樣本進行100倍稀釋，因此計算得到的樣本HBsAg含量不超過有效范圍，單位計為102U/mL。

1.9 免疫組織化學法檢測肝組織中HBsAg和HBcAg水平

將小鼠肝臟組織固定在4%多聚甲醛溶液中，隨后進行石蠟包埋和切片。切片經過脫蠟和水化、抗原修復、抗體孵育等操作后，用DAB染色并封固，置于光學顯微鏡下評估。免疫組織化學法檢測肝組織中HBsAg和HBcAg所使用的抗體（工作液稀釋比例）分別為：馬抗HBsAg（1∶100）和兔抗HBcAg（1∶200）一抗，兔抗馬IgG（1∶200）和山羊抗兔IgGH&L（1∶50）二抗。免疫組織化學檢測結果可示HBsAg表達在細胞質，HBcAg表達在細胞核；相應定位若在顯微鏡下觀察到棕褐色，則為抗原陽性信號。

1.10 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行實驗結果數據分析。所有實驗至少獨立重復3次，結果數據以±s表示。多組比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型建立成功

一共注射37只CBA/CaJ小鼠，尾靜脈高壓注射HBV cccDNA后第8周檢測小鼠血清中HBsAg和HBV DNA含量。將HBsAg陽性且HBV DNA載量大于105拷貝者，判定為HBV cccDNA模型陽性。結果顯示，HBV cccDNA模型陽性小鼠有36只，建模陽性率為97.30%（36/37）。

2.2 HBV感染急性期苦參堿和青蒿素的抑制作用

2.2.1 急性期給藥過程中小鼠血清HBsAg的表達

HBV感染急性期（即轉染HBV cccDNA后第8周）小鼠在苦參堿和青蒿素給藥前（第0周）及給藥后第1、2、3、4周，酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中HBsAg的表達水平（圖1A）。結果顯示，苦參堿和青蒿素對HBV cccDNA模型小鼠急性期HBsAg具有明顯的抑制效果，但前3周與生理鹽水對照組相比差異沒有統計學意義，僅在第4周HBsAg水平才明顯降低（P＜0.05）。

2.2.2 急性期給藥過程中小鼠血清HBV DNA的拷貝情況

對HBV感染急性期小鼠，采用實時定量PCR法檢測苦參堿和青蒿素給藥前及給藥后第4周的小鼠血清中HBV DNA含量（圖1B）。結果顯示，用藥后第4周，HBV cccDNA模型小鼠血清中HBV DNA拷貝數比生理鹽水對照組明顯減少（P＜0.01）。

2.3 HBV感染慢性期苦參堿和青蒿素的抑制作用

2.3.1 慢性期給藥過程中小鼠血清HBsAg的表達

小鼠轉染HBV cccDNA后第26周即攜帶HBV至26周，進入HBV感染慢性期，這時用同樣的濃度和方法給予小鼠苦參堿和青蒿素治療，并在給藥前及給藥后第2周和第4周各進行一次尾靜脈采血，然后采用酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中HBsAg水平（圖2A）。結果顯示，無論是第2周或第4周，與相應的生理鹽水對照組相比，HBsAg變化均不明顯（均P＞0.05）。

同時，分析用藥前HBsAg絕對值與用藥后第4周HBsAg絕對值之差，計算出相對降低水平（即ΔHBsAg），其結果如圖2B所示。結果表明，用藥后第2周，兩個藥物組和生理鹽水對照組的ΔHBsAg無明顯差異（均P＞0.05）；但是，用藥后第4周，與生理鹽水對照組的ΔHBsAg相比，苦參堿組和青蒿素組的ΔHBsAg均存在明顯差異（均P＜0.05）。

圖1 急性期CBA/CaJ小鼠經苦參堿或青蒿素治療后血清HBsAg（A）和HBV DNA水平（B）的變化 Figure 1 Serum HBsAg (A) and HBV DNA (B) levels in CBA/CaJ mice during acute phase after matrine or artemisinin treatment

2.3.2 慢性期給藥過程中小鼠血清及肝臟HBV DNA和HBV cccDNA拷貝數變化

在HBV感染慢性期，給藥后第4周收集小鼠血清及肝臟等樣本，分別提取病毒基因組DNA，采用實時定量PCR法檢測各組小鼠血清中HBV DNA（圖3A）以及肝組織中HBV DNA和HBV cccDNA（預先進行T5酶切處理）的拷貝情況（圖3B）。結果表明，苦參堿能明顯降低小鼠血清或肝組織中HBV DNA的拷貝數（P＜0.05，P＜0.01），也能明顯降低小鼠肝組織中HBV cccDNA的拷貝數（P＜0.05）；但是，青蒿素僅對血清中HBV DNA有明顯抑制作用（P＜0.05），而對肝組織中HBV DNA和HBV cccDNA作用均無明顯影響（均P＞0.05）。

2.3.3 慢性期給藥過程中小鼠肝組織HBsAg和HBcAg的表達

免疫組織化學法檢測給藥后HBV感染慢性期小鼠肝組織中HBsAg和HBcAg的表達情況，結果顯示，生理鹽水對照組和苦參堿、青蒿素給藥組中均能觀察到HBsAg和HBcAg陽性表達（圖4A）。對觀察到的陽性信號數量進行統計分析，結果（圖4B）顯示，苦參堿對HBsAg和HBcAg，以及青蒿素對HBsAg作用均不明顯（均P＞0.05）；但是，青蒿素對HBcAg表達有明顯的抑制作用（P＜0.05）。

綜上，HBV cccDNA轉染后HBV感染急性期和慢性期小鼠模型經苦參堿和青蒿素治療后，各藥物對HBV主要標志物有不同程度的抑制效果（表1）。

圖2 慢性期CBA/CaJ小鼠經苦參堿或青蒿素治療后血清中HBsAg水平變化（A）及相對降低水平（B）Figure 2 Serum HBsAg level (A) and decrease (B) in CBA/CaJ mice during chronic phase after matrine or artemisinin treatment

圖3 慢性期CBA/CaJ小鼠經苦參堿或青蒿素治療后血清（A）及肝臟（B）中HBV DNA或HBV cccDNA拷貝數Figure 3 The copy number of HBV DNA or cccDNA in serum (A) and liver tissues (B) of CBA/CaJ mice during chronic phase after matrine or artemisinin treatment

圖4 免疫組織化學法檢測慢性期CBA/CaJ小鼠經苦參堿或青蒿素治療后肝組織中HBsAg和HBcAg的表達水平（DAB染色，×200）（A）及其陽性信號數量統計結果（B）Figure 4 Immunohistochemical detection of the expression levels (DAB staining, ×200) (A) and the number of positive signals (B) of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and hepatitis B virus core antigen (HBcAg) in liver tissues of CBA/CaJ mice during chronic phase after matrine or artemisinin treatment

表1 HBV cccDNA轉染小鼠模型給藥4周后苦參堿和青蒿素對HBV的抑制效果評價Table 1 Inhibitory effects of matrine and artemisinin on HBV in HBV cccDNA mouse model after 4 weeks of administration

3 討論

苦參堿是從豆科槐屬植物苦參中分離出來的一種單體化合物，有效成分為生物堿，具有抗炎、抗病毒及抗腫瘤等藥理作用[12-13]。迄今，在抑制HBV作用方面，臨床試驗結果顯示，苦參堿單獨或聯合其他藥物能抑制肝細胞表達和分泌HBsAg，并抑制HBV DNA復制[6,15-17]。盡管苦參堿已被應用于慢性乙肝治療，但其更多的功能并不清楚。而來源于黃花蒿的青蒿素，在抑制HBV的作用方面目前報道較少。Romero等[11]利用HepG22.2.15細胞模型，初步證明青蒿素與拉米夫定聯合使用具有協同抗HBV的作用。因此，青蒿素作為抗HBV感染的抗病毒藥物值得進一步評價。

HBV的HBsAg和（或）HBV DNA在動物體內存在時間超過6個月時，即由急性HBV感染轉為慢性HBV感染[18]。另外，HBV感染免疫系統發育完善的成年人后，90%的成年人只是一過性感染，即表現為急性感染。而母嬰傳播導致新生兒HBV感染時，由于新生兒免疫功能尚未發育完善，不能清除母親傳染給的HBV，90%的新生兒會在感染超過6個月時發展成為慢性乙肝[19]。因此，探索不同時期的藥物作用效果，對指導臨床用藥具有十分重要的意義。

近年來，HBsAg定量檢測已在臨床中被廣泛應用，其水平可以反映疾病分期與疾病進展風險。HBV DNA定量主要用于評估HBV感染者體內的病毒復制水平，是抗病毒治療適應癥選擇及療效判斷的重要指標。另外，HBcAg在區分疾病分期、預測肝細胞癌發生風險方面是一個重要的相關性指標[18]。同時，cccDNA是HBV進入細胞、建立感染后進行復制和增殖的直接模板[20]，是現有的抗病毒藥物治療亦難以清除的主要遺傳物質[21]，也是乙肝藥物研究的“終極”靶點[22]。因此，檢測上述指標可有效評估藥物的作用效果。

本研究首先應用課題組前期建立的技術體系，高壓注射體外合成的HBV cccDNA于37只免疫功能正常的CBA/CaJ小鼠尾靜脈后，發現HBsAg陽性且HBV DNA大于1×105拷貝/mL的小鼠有36只，模型成功率達97.30%。隨后的實驗結果證實，該模型的HBV標志物，尤其是HBV cccDNA均能表達，病毒攜帶時限可長達半年以上，與前期實驗結果[8-10]一致。該模型的成功建立，為后續藥效評價奠定了基礎。

隨后，本課題組將36只HBV cccDNA陽性小鼠模型分成HBV感染急性期和HBV感染慢性期，系統觀察苦參堿和青蒿素對HBV主要標志物的抑制效果。在感染急性期，苦參堿和青蒿素既能夠明顯抑制血清中HBsAg的分泌，又能降低血清HBV DNA的復制；結果提示，苦參堿和青蒿素對HBV感染急性期的患者作用明顯。在感染慢性期，苦參堿和青蒿素能明顯降低血清中ΔHBsAg及HBV DNA水平；前者結果未見報道，而后者與以往文獻報道的體外實驗結果及臨床結果[6,11,22-24]基本一致。同時本研究還發現，在感染慢性期，苦參堿和青蒿素對血清和肝組織中HBsAg的抑制作用不明顯；這與已報道的臨床結果[6,22-24]有一定差異，可能是本研究中生理鹽水對照組與兩個藥物組的起始HBsAg水平不一致所致。進一步觀察苦參堿和青蒿素對肝組織中HBV標志物的作用，結果發現，苦參堿和青蒿素對HBsAg均無明顯作用。更有趣的是，本研究還發現苦參堿和青蒿素對HBV的作用效果是不同的：苦參堿能有效抑制HBV DNA和HBV cccDNA，而對HBcAg無明顯抑制作用；相反，青蒿素能有效抑制HBcAg，而對HBV DNA和HBV cccDNA無明顯抑制作用。以上研究結果提示：苦參堿和青蒿素在小鼠體內對肝組織中的HBV有一定程度的抑制作用，同時兩種藥物的抗HBV作用機制可能存在一定差異。

綜上所述，本研究首次應用免疫正常的HBV cccDNA轉染小鼠模型在急性感染期和慢性感染期進行了苦參堿和青蒿素抗HBV有效性評價的示范研究，結果發現苦參堿和青蒿素對HBV均有不同程度的抑制作用，這一結果與以往文獻報道[23-24]基本一致。除此之外，本研究結果還豐富了苦參堿和青蒿素對HBV感染慢性期肝組織中標志物cccDNA、HBcAg等的作用功效評價數據，為使用苦參堿和青蒿素進行抗HBV治療提供了新的理論依據。后續本課題組還將充分利用該小鼠模型的優勢進一步開展藥物作用機制，尤其是免疫機制的研究，以期為HBV急性感染期和慢性感染期藥物評價提供更多數據支持。