皮膚光老化小鼠模型的構建及效果評估

孔 悅，郭 硯

（1. 青海大學研究生院，西寧 810001；2. 青海大學附屬醫院醫學美容科，西寧 810001）

皮膚是人體最淺表且最大的器官，在保護人體免受環境損害和進行物質交換方面發揮了重要作用。皮膚衰老是一個由基因和外界環境因素等共同導致的復雜過程。皮膚老化分為內源性老化和外源性老化。內源性老化是指由基因決定的隨著時間推移產生的自然老化。外源性老化是指環境因素如紫外線輻射、吸煙、毒害化學品等影響下產生的皮膚損害積累，其中紫外線輻射是導致外源性老化最主要的因素[1]。因此，外源性老化又稱為皮膚光老化。建立有效的皮膚光老化動物模型，是研究及防治人體皮膚光老化的基礎。

日光中的紫外線（ultraviolet，UV）分為3個波段：短波紫外線（UVC，190～290 nm）、中波紫外線（UVB，290～320 nm）和長波紫外線（UVA，320～400 nm）[2]。其中 UVC 幾乎全被臭氧層吸收，到達地面的主要為 UVA 和UVB；UVA 的活性很低，而UVB 活性是 UVA活性的1000倍[3]。UVB主要導致皮膚表皮層和真皮淺層的損傷[4]，可引起皮膚松弛、干燥、粗糙、皺紋加深、色素沉著等，甚至可以導致皮膚癌[5]。另一方面，D-半乳糖是生物體內一種生理性的營養成分，在正常代謝中可以轉化為葡萄糖。有研究發現，持續給動物注射大劑量D-半乳糖可引起與自然衰老相似的生理生化改變[6-8]。因此，本實驗采用窄譜 UVB（311～312 nm）輻射聯合D-半乳糖皮下注射的方法建立小鼠皮膚光老化模型，并評估其建模效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養環境

SPF級雄性KM小鼠30只，45日齡，體質量為22～25g，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心[SCXK（陜）2018-001]。實驗小鼠飼養及造模在青海大學醫學院高原醫學研究中心SPF級實驗室[SYXK（青）2020-001]進行，實驗期間小鼠自由攝食飲水。本研究獲得青海大學附屬醫院科研倫理委員會的審核批準（編號為P-SL-2017066）。

1.2 主要試劑

D-半乳糖和強效RIPA裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司，HE染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所，聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白定量試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）檢測試劑盒、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）檢測試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，兔抗鼠基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、c-fos、c-jun單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗鼠 β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京索萊寶科技有限公司，電化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）購自德國Merck Millipore公司。

1.3 主要儀器

40 W UVB燈（311～312 nm，TL 40W/01-RS）為德國Philips公司產品，UVB輻照度監視器（UV-340A）為中國臺灣路昌電子企業股份有限公司產品，電泳儀（PowerPac HC）和化學發光成像儀（ChemiDoc XRS）為美國Bio-Rad公司產品，全波長酶標儀（Multiskan GO）為美國Thermo Fisher公司產品。

1.4 動物分組處理

在22～25 ℃、相對濕度為60%的環境下，實驗小鼠自由飲水進食，適應性飼養1周后，通過隨機數字表法分為對照組和模型組，每組15只。所有小鼠背部使用4%硫化鈉溶液除去表面毛發，暴露大小約4 cm×4 cm的皮膚，間隔5 d脫毛一次。模型組每日于頸背部皮下注射5%D-半乳糖10 mg/kg；并且將UVB燈置于小鼠上方40cm垂直高處，照射前測輻射強度，每次輻射劑量為120 mJ/cm2，持續40 d。對照組每日于頸背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液（即生理鹽水）10mg/kg，但正常光照飼養。

1.5 皮膚肉眼觀察及組織病理學觀察

造模過程中，肉眼觀察比較對照組和模型組照射后小鼠皮膚的光澤、光滑度等變化情況。實驗第42天，所有小鼠經腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死，剪取頸背部的脫毛皮膚約4 cm×4 cm大小，送至青海大學附屬醫院中心實驗室進行后續操作。去除皮下多余脂肪，取部分皮膚標本攤平后，用4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm厚切片，然后行常規HE染色及Masson染色。余下皮膚組織保存于－80℃待用。

1.6 酶生化法檢測皮膚組織中SOD、MDA、HYP和GSH-PX含量

取出部分冷凍的小鼠皮膚組織，用眼科剪剪碎后，按照組織質量（g）∶試劑體積（mL）為1∶9的比例加入0.9%氯化鈉溶液，置于冰水浴中勻漿，2000×g低溫離心10 min。取上清液，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成1%的皮膚組織勻漿液，然后按照試劑盒說明書操作，測定SOD、GSH-PX活性和MDA、HYP含量。

1.7 蛋白質印跡法檢測皮膚組織中MMP-1、c-fos和c-jun的表達

取小鼠背部皮膚，眼科剪剪碎后加入 RIPA裂解液，4 ℃、12000×g離心5 min后，取上清液。采用BCA法測定上清液中蛋白濃度，進行SDS-PAGE，然后將電泳分離的條帶轉移至PVDF膜；用1% BSA封閉1 h后，加入1∶2000稀釋的一抗（兔抗鼠MMP-1、c-fos、c-jun和β-actin單克隆抗體），4℃孵育過夜；再加入1∶10000稀釋的二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG），室溫孵育50 min；然后用 ECL 發光液顯色，應用Image J軟件進行顯色條帶分析。

1.8 統計學方法

使用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。每個樣本重復檢測3次，計量資料以±s表示。組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠皮膚的肉眼觀察

在造模第10、20、30及40天對兩組小鼠背部裸露皮膚拍照，肉眼觀察結果如圖1所示。可發現同一時間，與對照組相比，模型組小鼠經UVB照射后皮膚顏色變紅，變松弛，并且明顯干燥、脫屑、粗糙，甚至出現皺紋。

圖1 兩組小鼠皮膚肉眼觀察Figure 1 Visual inspection of skin of mice in two groups

2.2 兩組小鼠皮膚組織的HE 染色

HE染色結果如圖2A所示，低倍鏡（×10）下，與對照組相比，模型組小鼠UVB照射后表皮變厚，真皮膠原纖維疏松；高倍鏡（×40）下，與對照組相比，模型組小鼠經UVB照射后真皮層膠原纖維及彈力纖維缺失、斷裂、卷曲，結構松散，排列紊亂。

2.3 兩組小鼠皮膚組織的Masson 染色

Masson染色結果如圖2B所示，低倍鏡（光鏡×10）下可發現，與對照組相比，模型組的表皮角質層變薄，真皮層膠原纖維含量減少。高倍鏡（光鏡×40）下可見，對照組膠原纖維分布均勻，排列緊密整齊；而模型組膠原纖維分布不均，含量減少，出現斷裂，排列紊亂。

2.4 小鼠皮膚組織的生化指標檢測

兩組小鼠皮膚組織中各生化指標的檢測結果如圖3所示。與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中SOD和GSH-PX活性明顯降低，HYP含量明顯減少，MDA含量明顯增多，差異均具有統計學意義（t值分別為24.578、22.803、14.477和18.260，P值均＜0.01）。

圖2 兩組小鼠皮膚組織的HE 染色（A）和 Masson染色（B）結果Figure 2 HE staining (A) and Masson staining (B) results of skin tissues of mice in two groups

圖3 兩組小鼠皮膚組織中SOD、HYP、MDA和GSH-PX含量Figure 3 Contents of SOD, HYP, MDA and GSH-PX in skin tissues of mice in two groups

2.5 小鼠皮膚組織中MMP-1、c-fos和c-jun蛋白的表達

兩組小鼠皮膚組織蛋白質印跡法檢測結果見圖4。與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中MMP-1、c-fos、c-jun 表達水平明顯升高，差異均具有統計學意義（t值分別為11.814、10.786和7.717，P值均＜0.01）。

圖4 兩組小鼠皮膚組織中MMP-1、c-fos和c-jun蛋白的表達量Figure 4 Expressions of MMP-1, c-fos and c-jun in skin tissues of mice in two groups

3 討論

隨著社會老齡人口的增加，人們對皮膚衰老的關注度日益提高。皮膚衰老中80%都是光老化，因此有關光老化的研究具有重要意義，而建立簡單有效的光老化動物模型可為光老化相關研究提供基礎。在實驗動物方面，有研究證實，無毛鼠可以直接用于光老化造模，且其發生的皮膚損傷與人類皮膚光老化極為相似[9]；但是由于無毛鼠的價格昂貴，國內學者多選擇人工脫毛后的實驗鼠來構建皮膚光老化的動物模型[10-12]。

在光老化造模的光源方面，目前人們常用的是UVB和UVB＋UVA輻射。而本研究選用的是UVB 照射，同時聯合D-半乳糖皮下注射，成功建立了小鼠皮膚光老化模型。與UVB輻射模型和UVB＋UVA輻射模型相比，本研究的造模時間更短，并且兼顧內源性老化和外源性老化，更加符合實際；而且本研究建模小鼠的皮膚光老化情況更加符合自然狀態下受UV輻射和內環境共同影響的皮膚狀況。另外，與UVB＋UVA聯合輻射模型相比，雖然本研究的UVB光源較單一，但其活性遠高于UVA，是導致皮膚光老化的主要因素；為了使造模更加經濟、簡便，故本研究選用UVB聯合D-半乳糖皮下注射的方法建立小鼠皮膚光老化模型。

氧化應激是皮膚光老化的機制之一[13]。UV輻射可誘導機體產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而導致組織損傷，細胞內酶抗氧化系統中的SOD和GSH 被大量消耗，氧化的終產物MDA增多，間接反映了機體細胞的氧化損傷程度[2]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類需要鈣、鋅等金屬離子作為輔助因子的蛋白水解酶，幾乎可以水解細胞外基質中的全部蛋白成分[14]。UV輻射可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路，從而增加MMPs 的表達[15-16]。MMPs參與皮膚光老化、皮膚創傷修復等過程的細胞外基質重構[17]。而且MMPs可以破壞皮膚膠原蛋白，這是皮膚老化的直接原因[18]。其中，MMP-1可降解Ⅰ型和Ⅲ型纖維膠原蛋白，引起膠原纖維的碎裂，在細胞外基質的修復過程中起到重要作用[19]。細胞核內原癌基因c-fos和c-jun屬于傷害性信息與即刻早期基因，其編碼的蛋白為轉錄因子，可誘導下游基因的轉錄和表達，在細胞增殖和凋亡中起到重要的調節作用[20]。

本實驗結果顯示，模型組小鼠的皮膚肉眼可見變紅、松弛、粗糙、色素沉著、皺紋增加等；病理觀察可發現表皮增厚，膠原纖維含量減少，排列紊亂。而且，模型組小鼠的皮膚組織中SOD和GSH活性降低，HYP含量減少，而MDA含量增多，MMP-1和 c-fos、c-jun 表達也明顯增多，與自然光老化皮膚的損傷機制一致[21-22]。因此，本研究的造模方法可用于復制有效的小鼠皮膚光老化模型。

需要說明的是，本研究未對皮膚光老化損傷程度與UVB輻射強度和D-半乳糖注射劑量之間的關系做深入分析，今后擬通過設置不同的UVB輻射強度和不同的D-半乳糖劑量組，進一步探討造模過程中UVB輻射強度及D-半乳糖劑量對光老化損傷程度的影響。