干旱脅迫對黃果柑果實品質及糖酸代謝酶活性的影響

龔成宇，王 毅，2，宋海巖，3，楊 科，陶海青，劉俊宏，龔榮高*

(1.四川農業大學園藝學院，四川 成都 611130；2.廣元市利州區工業集中發展區管理委員會，四川 廣元 628018；3.四川省農業科學院園藝研究所/農業農村部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】黃果柑(Citruscultivarcv.Huangguogan)隸屬蕓香科(Rutaceae)柑桔屬(Citrus)，為桔橙的天然雜交種，是我國大渡河流域石棉、漢源等干暖河谷地帶特有的柑桔寶貴資源[1]。干旱脅迫是近年來植物面臨較大的環境脅迫因子之一[2]。干旱脅迫常常會對果樹的形態生理、生長發育、果實產量和多種內含物的代謝過程造成極大影響，并且由于干旱脅迫程度和果樹種類的不同，所表現出的規律性也不相同[3]?！厩叭搜芯窟M展】干旱脅迫對果實外在品質的影響主要體現在果實變小、硬度增大等方面[4]。在枇杷[5]、鴨梨[6]、草莓[7]和葡萄[8]的研究中均表明果實的可溶性固形物、可溶性糖含量及糖酸比值在水分脅迫下有一定的提升，張萍等[9]在枸杞的研究中也發現適當的干旱脅迫處理有利于果實中己糖的積累，果實產量降低但果實品質變優，姜妮等[10]與石學根等[11]對柑橘的研究表明一定的水分脅迫有利于糖分含量增加，但對果實有機酸含量的影響并不明顯，而鄧勝興[12]的研究卻表明土壤相對含水量與果實有機酸含量呈極顯著負相關。蒲雪荔[13]研究表明，果實發育初期受到AI、SS分解作用較大，而NI(蔗糖中性或堿性轉化酶)、SS合成發揮作用的階段主要是果實發育中后期，SPS是整個果實發育過程中可溶性糖積累的關鍵酶；CS(檸檬酸合成酶)、PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、ACO、NAD-IDH和MDH(蘋果酸脫氫酶)均是影響柑橘果實有機酸代謝的重要酶?！颈狙芯壳腥朦c】目前黃果柑的主要產地氣候干熱少雨，年降水量分布不均，春季干旱現象嚴重，黃果柑產業已深受當地氣候影響。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過研究不同程度干旱脅迫下黃果柑的果實品質變化以及糖酸代謝變化，為全面揭示干旱脅迫對黃果柑果實生長發育及糖酸代謝機制的影響提供參考，更為結合生產地氣候因素找到黃果柑增糖降酸以及提質增效的產業技術研發提供理論基礎和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗地點位于雅安市漢源縣小堡藏族彝族鄉解放村(N 29°18′,E 102°33′，海拔950 m)，地處大渡河中游干暖河谷區域，亞熱帶氣候區，少雨且不均，年均降水量在650 mm左右，土壤類型為紅壤土。供試材料為7年生晚熟黃果柑，砧木為枳殼，植株健壯、樹勢一致，常規栽培管理措施。

1.2 試驗方法

所有材料從2018年4月開始統一管理，對試驗田進行地膜覆蓋和挖溝排水來避免降雨對試驗處理的干擾，處理開始后每3 d用德國STEPES MST3000+型便攜式水分測定儀進行一次土壤相對含水量的測定，通過多排少補的方式使各處理的土壤相對含水量于花后30 d左右開始長期處于試驗設置的范圍內，各處理如表1所示，以單個小區為一個處理，每個小區3株黃果柑樹體，每個處理重復3次。分別于達到干旱脅迫程度后的30 d(即花后60 d)開始對每個處理的果實進行收集，果實的收集按照每棵樹的東、南、西、北4個方位采摘大小一致、無病蟲害且無機械損傷的黃果柑果實，此后每30 d采集一次樣品直至果實成熟，樣品采集次數共計10次。每次采集的樣品立即放入冰盒帶回實驗室，用于糖酸組分含量及糖酸代謝酶活性指標測定的樣品果實切成對稱的4份，取每份的中間部分果肉用液氮品保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 黃果柑果實的品質 指標通過天平和游標卡尺測定果實相關外觀品質指標，FR-5105型硬度計測定果實硬度?？扇苄怨绦挝锖坷檬殖质秸酃鈨x(手持式糖度計)測定，Vc含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定[14]。可溶性總糖含量的測定用斐林試劑法，有機酸總含量的測定采用NaOH中和滴定法。

1.3.2 黃果柑果實中糖酸組分含量 參照肖玉明[15]的高效液相色譜(HPLC)法進行黃果柑果實糖酸的提取與測定。

1.3.3 黃果柑果實中相關糖酸代謝酶活性 黃果柑果實中相關糖酸代謝酶酶液的制備和酶活性的測定均參照龔榮高[16]的方法。

1.4 試驗數據統計與分析

所有指標重復測定3次后取平均值。通過Microsoft Excel 2010、SPSS20.0和Origin85等平臺對數據進行整理、檢驗并繪圖。

表1 各脅迫處理的土壤相對含水量范圍

表2 干旱脅迫對黃果柑成熟果實單果重、可食率及縱橫徑的影響

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對黃果柑成熟果實果實品質的影響

由表2可知，黃果柑成熟果實的單果重與干旱脅迫程度表現出極顯著負相關，果實縱、橫徑均與干旱脅迫程度表現出顯著負相關，但各處理間的果形指數和可食率卻以LD處理下最大，且各處理間未達到顯著差異水平。說明干旱脅迫顯著影響了黃果柑的果實大小，但對果形變化和可食率的影響并不顯著。由表3可知，黃果柑成熟果實的Vc含量和有機酸含量均隨著脅迫程度的加重而降低，而可溶性固形物含量、可溶性總糖含量及糖酸比均以LD處理下的果實最大。其中，果實的Vc含量、有機酸含量及糖酸比均在各處理間達到顯著差異水平，果實可溶性總糖含量差異達到極顯著水平，說明干旱脅迫對黃果柑果實內含物的含量具有顯著影響，尤其表現在對果實可溶性糖含量的影響。

2.2 干旱脅迫對黃果柑果實發育過程中糖含量的影響

由圖1可知，果實發育后期蔗糖含量明顯高于葡萄糖和蔗糖含量，說明黃果柑的糖積累以蔗糖為主。從干旱脅迫后的90 d開始，各處理間可溶性總糖含量表現為LD>CK>SD，直到果實完熟，LD處理的果實可溶性總糖含量較CK處理高11.45 %，而SD較CK處理則降低了6.61 %。各脅迫處理間的糖組分含量差異主要發生在果實成熟后期，蔗糖含量差異表現為LD>SD>CK，葡萄糖和果糖含量均表現出與可溶性總糖含量相一致的差異，即LD>CK>SD，說明LD處理能較大程度地提升果實中可溶性總糖及各糖組分含量，而SD處理雖然對果實中蔗糖含量有一定的提升，但降低了果實中果糖和葡萄糖的含量，從而抑制了果實可溶性總糖的積累。

2.3 干旱脅迫對黃果柑果實糖代謝相關酶活性的影響

2.3.1 干旱脅迫對黃果柑果實蔗糖合成酶類活性的影響 由圖2可知，果實發育前期SS合成方向及SPS的活性在各脅迫處理間并沒有表現出顯著差異。自脅迫處理后的180 d開始，SS合成方向的活性在各脅迫處理間表現為與可溶性總糖一致的規律，即LD>CK>SD。SPS活性自脅迫處理后的180 d開始在各脅迫處理間表現出相對明顯的差異規律，這一差異規律與總糖積累的不同，但與各處理間蔗糖的積累差異規律一致，即LD>SD>CK，且除脅迫處理后的240 d以外，其余各時期各處理間均達到顯著差異水平，由此說明，SS合成方向是各脅迫處理間果實可溶性總糖積累后期出現差異的關鍵因素，而SPS則是引起各脅迫處理間果實蔗糖積累后期出現差異的關鍵酶。

2.3.2 干旱脅迫對黃果柑果實蔗糖分解酶類活性的影響 由圖3可知，黃果柑果實發育過程中， AI和SS分解方向的活性都呈現出整體降低的趨勢，而后期NI活性遠遠高于AI，由此說明，在果實發育前期，果實形態構建高峰需要消耗大量糖分解所提供的能量。前期，果實蔗糖分解酶類中對果實糖積累的影響主要由SS分解方向和AI活性所決定，而進入果實膨大期以后，NI是影響糖積累的關鍵酶。從各脅迫處理間酶活性的差異來看，在整個發育過程中各脅迫處理間NI活性均未表現出顯著差異，而SS分解方向的活性在脅迫處理前期表現出一定的差異，但未達到顯著水平。由此，前期果實糖積累的過程可能與SS分解方向的活性有關。自脅迫處理后150 d開始，AI表現為CK>SD>LD，由此說明，在黃果柑果實蔗糖分解酶中，NI和SS分解方向的活性雖然高于AI，但是脅迫處理間的糖積累差異主要由AI造成。

表3 干旱脅迫對黃果柑成熟果實部分內含物指標的影響

2.4 干旱脅迫對黃果柑果實發育過程中酸含量的影響

由圖4可知，黃果柑生長發育過程中檸檬酸在有機酸中占比達50 %～95 %，蘋果酸和奎寧酸后期占比極低，說明黃果柑酸代謝以檸檬酸為主。各脅迫處理下的果實檸檬酸和有機酸含量均在脅迫處理后90 d達到積累峰值，隨后便表現出不同程度的降解，而蘋果酸和奎寧酸均表現出了“L”型的降解趨勢，其降解程度表現為SD>LD>CK，果實成熟后期，各脅迫處理間果實有機酸和酸組分含量均表現為CK>LD>SD，其含量差異與降解程度相反，其中，果實成熟時SD與LD處理的果實有機酸含量分別較CK處理顯著降低，降幅達27.24 %和17.59 %，由此可以推斷果實最終有機酸含量的差異并非完全由果實有機酸的積累量所決定，而是由酸的降解程度所決定，且干旱脅迫處理有利于黃果柑果實中酸的降解。

2.5 干旱脅迫對黃果柑果實有機酸代謝相關酶活性的影響

2.5.1 干旱脅迫對黃果柑果實有機酸合成酶類活性的影響 由圖5可知，脅迫前期果實中CS、PEPC與MDH活性均快速升高，與有機酸含量的迅速積累保持一致，而脅迫后期除CS的活性還保持一個相對較高的狀態外，PEPC與MDH的活性則伴隨著黃果柑果實中有機酸含量的穩定均降低到發育全程的最低水平，且這3種酶的酶活性在不同程度脅迫處理的果實間均沒有表現出較強的差異規律性。由此說明，黃果柑果實中CS、PEPC和MDH的活性對果實發育前期有機酸的積累具有重要影響，但不同程度干旱脅迫間果實有機酸含量的差異并不是由CS、PEPC和MDH酶活性所決定的。

2.5.2 干旱脅迫對黃果柑果實有機酸分解酶類活性的影響 由圖6可知，細胞質ACO和NAD-IDH均在果實發育的中后期保持著相對較高水平的活性，說明細胞質ACO和NAD-IDH是黃果柑果實發育酸降解過程中的重要酶。在各脅迫處理間，果實中線粒體ACO全程沒有表現出明顯的活性差異，細胞質ACO和NAD-IDH自脅迫處理后150 d開始，各處理間活性差異表現為SD>LD>CK，與各處理間果實成熟后期有機酸降解階段的降解程度差異一致。說明，有機酸降解階段細胞質ACO和NAD-IDH是造成不同干旱脅迫處理間果實有機酸含量差異的主要酶。

3 討 論

現有研究認為適度的干旱脅迫會導致果實變小，硬度增大，在少量降低果實有機酸含量和Vc含量的前提下能夠有利于可溶性固形物、可溶性糖的積累[17-18]。本試驗結果表明干旱脅迫會抑制果實大小的發育，而對果形不會造成太大的影響，輕度干旱脅迫在適度降低果實外觀品質的前提下能有效提升黃果柑的內在品質，而重度脅迫顯然會降低果實的整體品質，這與前人的研究結論基本一致。糖代謝方面，輕度干旱脅迫顯著提升了黃果柑果實中可溶性總糖及糖組分含量，而重度干旱脅迫雖然提升了果實中蔗糖的含量，卻抑制了葡萄糖、果糖及可溶性總糖含量，猜想這可能是由于在重度干旱脅迫環境下，成熟期果實內部更容易發生葡萄糖和果糖向蔗糖的轉化。進一步研究表明SS合成方向的活性自脅迫處理后180 d開始與各脅迫處理間可溶性總糖含量表現為一致的差異規律，AI在各處理間表現出了與果實蔗糖含量相反的差異趨勢，結合SPS的活性差異驗證了重度脅迫能加快果實果糖和葡萄糖向蔗糖的轉化從而提升果實蔗糖含量的猜想，但其酶活性的差異對不同程度干旱脅迫間葡萄糖、果糖以及可溶性總糖含量的差異影響并不明顯，這可能是由于其酶活性差異雖然顯著，但整體活性較低所造成的。說明SS合成方向是各脅迫處理間在果發育后期可溶性總糖含量出現差異的關鍵酶，而SPS和AI則是引起各脅迫處理間果實蔗糖積累出現差異的關鍵酶，這與曹淑燕等[19]在研究相同管理水平下株間黃果梢果實糖含量差異所找到的影響關鍵酶所一致。柑橘酸代謝方面，Yamaki[20]研究發現10余種柑橘有機酸組分，但大部分柑橘以檸檬酸代謝為主，本研究表明黃果柑果實有機酸的積累也是以檸檬酸為主。干旱脅迫能加強黃果柑果實發育后期檸檬酸、蘋果酸和有機酸的降解程度，且干旱脅迫程度越大，果實中酸含量的降低越顯著，這與張規富[21]干旱脅迫對寬皮柑橘的影響結果一致，但鄧勝興[12]與肖明玉[15]在溫州蜜柑上的研究結果卻認為，隨著干旱脅迫程度的增大，果實有機酸含量會發生顯著升高，這可能是由于柑橘品種間或不同栽培地柑橘樹體對干旱脅迫的適應性不同所造成。進一步研究表明，整個果實發育期，PEPC、MDH與線粒體ACO在不同程度干旱脅迫處理間均沒有表現出顯著差異，而果實發育后期，各處理間的細胞質ACO與NAD-IDH活性差異表現出與各處理間有機酸降解程度所一致的規律。說明細胞質ACO與NAD-IDH是造成不同程度干旱脅迫對黃果柑果實有機酸含量差異的主要酶，且干旱脅迫程度越高，2種酶的酶活性越高，從而有利于黃果柑果實有機酸的降解。曹淑燕等[19]在不同砧木對黃果柑果實有機酸代謝相關酶活性的影響研究也認為，砧木間果實有機酸差異是ACO和NAD-IDH活性共同作用的結果，這與本研究的結果具有一致性。

4 結 論

輕度干旱脅迫在適度降低果實大小的前提下較大程度地提升果實中可溶性總糖及各糖組分含量，降低酸含量，有效提升了黃果柑的內在品質，而重度干旱脅迫雖然提升了果實蔗糖的含量，但限制了果實葡萄糖、果糖及可溶性總糖的積累，降低了黃果柑的整體品質。糖代謝方面，SS合成方向是各脅迫處理間果實可溶性總糖含量出現差異的關鍵酶，而SPS和AI則是引起各脅迫處理間果實蔗糖含量出現差異的關鍵酶。酸代謝方面，黃果柑果實中細胞質ACO與NAD-IDH是造成干旱脅迫下有機酸含量差異的關鍵酶，干旱脅迫能有效提升這2種酶的酶活性從而加劇黃果柑果實中有機酸的降解。