咖啡因對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用及機制

干春霞，胡財江，王立甜，高梓琪，李 今， 徐 晶，王宣軍,3，盛 軍，徐歡歡,3*

(1.云南農業大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；3.云南農業大學理學院，云南 昆明 650201；4.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設備

人永生化表皮角質細胞(HaCaT)購于中國科學院昆明細胞庫；高糖培養基DMEM/HIGH GLUCOSE(Thermo)；FBS(Foetal Bovine Serum，胎牛血清)購于Biological Industries公司；胰蛋白酶—EDTA消化液(T1300)、青鏈霉素混合液(P1400)、高效RIPA裂解液(R0010)購于北京Solarbio Life Science公司。

咖啡因(Caffeine)、二甲基亞砜、組織固定液、結晶紫購于美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)購于Beyotime生物技術公司；MMP9抗體(ab76003)、Acetyl-p53抗體(ab109396)購于Abcam公司；p-p38一抗(4511)、p-ERK一抗(4370)、p-JNK一抗(9255)、SIRT3一抗(5490)購于Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG購于R&D Systems公司；細胞質活性氧熒光染料CM-H2DCFDA(C6827)、特異性線粒體超氧化物熒光染料MitoSOX Red(M36008)購于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

細胞培養箱(BINDER)；移液器(Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；Automated cell counter(C10281，Invitrogen)；酶標儀(Thermo)；低速離心機(中佳 SC-3616)。

1.3 方法

1.3.1 氧化損傷細胞模型建立 復蘇人永生化表皮角質細胞(HaCaT)，在含有10 %胎牛血清的高糖細胞培養基中培養，置于含5 % CO2、37 ℃的培養箱中，連續傳代2次使得細胞生長活力一致且細胞狀態穩定。經過前期預實驗，使用功率為20 W的UVB紫外照射燈管對貼壁50 %左右的HaCaT細胞進行照射，構建UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷模型，輻射劑量為0.53 J·cm-2。實驗設4組處理：處理1(咖啡因0 μg·mL-1、無UV照射)、處理2(咖啡因0 μg·mL-1、UV照射)、處理3(咖啡因50 μg·mL-1、UV照射)和處理4(咖啡因100 μg·mL-1、UV照射)。

1.3.2 結晶紫染色實驗 以建立的HaCaT細胞氧化損傷模型為基礎，通過結晶紫染色實驗檢測咖啡因對于細胞生長的影響。各組細胞以80萬每皿的細胞密度接種至60 mm培養皿中過夜，待細胞貼壁牢固且細胞密度為50 %左右時對各組細胞進行咖啡因預處理1 h，然后進行UV照射。24 h后緩慢吸除培養基，用PBS清洗2～3次，使用4 %多聚甲醛固定20 min，固定結束后用UP水清洗1次，使用0.1 %結晶紫染液染色10 min，用UP水小心清洗3次后拍照記錄。

1.3.3 細胞內活性氧含量測定 將各組細胞以10萬每孔的密度接種至已經放入細胞爬片的12孔板，待細胞貼壁牢固且細胞密度為50 %左右時對各組細胞進行咖啡因預處理及UV照射，24 h后去除培養基，用PBS清洗2次，加入含有5 μmol/L熒光染料的無酚紅培養基1 mL，于37 ℃細胞培養箱孵育15 min。取出細胞爬片貼在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光強度并拍照記錄[25]。使用Image J軟件分析各組熒光強度的相對量。

1.3.4 線粒體內活性氧含量測定 與細胞內活性氧含量檢測方式一致，各組細胞分別經過誘導處理24 h后，加入含有5 μmol/L熒光染料的無酚紅培養基1 mL，于37 ℃細胞培養箱孵育15 min。取出細胞爬片并貼在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光強度并拍照記錄[25]。使用Image J軟件分析各組熒光強度的相對量。

1.3.5 蛋白免疫印跡 以建立的HaCaT細胞氧化損傷模型為基礎，通過蛋白質免疫印跡探究咖啡因對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用機制。各組HaCaT細胞經過誘導處理24 h后，消化、離心，收集細胞。用RIPA蛋白高效裂解液提取各組細胞中的總蛋白，用BCA蛋白定量法測得各組細胞總蛋白濃度。每組上樣20 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，2 h后轉PVDF膜，用5 %的脫脂奶粉封閉1 h后與p-p38、p-ERK、p-JNK、MMP9、SIRT3、Acetyl-p53及β-tubulin一抗孵育，4 ℃過夜。一抗回收后用TBST洗滌3次，室溫與兔抗或鼠抗IgG二抗孵育1 h。孵育結束后TSBT洗滌3次，利用ECL化學發光法顯影檢測。使用AlphaView軟件分析各目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 數據處理 所有數據以均值±標準誤差(X ± SEM)表示，兩組間差異采用t檢驗。*表示與處理1相比，差異顯著(P<0.05)；**表示與處理1相比，差異極顯著(P<0.01)；***表示與處理1相比，差異高度顯著(P<0.001)；#表示與處理2相比，差異顯著(P<0.05)；##表示與處理2相比，差異極顯著(P<0.01)；###表示與處理2相比，差異高度顯著(P<0.001)。圖像采用 GraphPad Prism5.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 咖啡因對UV照射后HaCaT細胞存活率的影響

與處理1相比，處理2的HaCaT細胞經過紫外線照射后，細胞存活率顯著降低(圖1)，說明造模成功；與處理2相比，處理3和處理4的細胞存活率顯著增加，并且呈現濃度依賴趨勢。由結晶紫染色結果可看出，咖啡因能增加UV照射后HaCaT細胞存活率。

2.2 咖啡因對UV照射后HaCaT細胞內活性氧積累的影響

為明確咖啡因對UV誘導HaCaT細胞損傷的保護作用，采用CM-H2DCFDA熒光染料對細胞內活性氧含量進行檢測。熒光染色結果顯示，咖啡因能顯著減少UV照射引起的HaCaT細胞內的活性氧累積(圖2)。與處理1相比，處理2細胞經紫外線照射后，細胞內活性氧含量顯著增加(P<0.001)；與處理2相比，處理3細胞內的活性氧的含量顯著降低(P<0.05)，處理4細胞內的活性氧的含量極顯著降低(P<0.01)，表明咖啡因減少了UV照射引起的細胞內活性氧的積累。

2.3 咖啡因對UV照射后HaCaT細胞線粒體內活性氧積累的影響

細胞內活性氧增加的同時也伴隨著線粒體內活性氧的增加。為研究UV照射對HaCaT細胞線粒體的損傷和咖啡因的保護作用，采用MitoSOX Red熒光染色檢測線粒體內活性氧的含量。圖3顯示，與處理1相比，處理2 HaCaT細胞線粒體內活性氧含量顯著增加(P<0.01)；而與處理2相比，處理3線粒體內活性氧含量有下降趨勢，處理4線粒體內活性氧含量極顯著降低(P<0.01)。表明咖啡因處理具有減少UV誘導的HaCaT細胞線粒體內活性氧積累的作用。

2.4 咖啡因對UV照射后HaCaT細胞內SIRT3/MAPKs通路的影響

為明確咖啡因對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護機制，采用Western blot評價了咖啡因對UV誘導的HaCaT細胞氧化應激重要信號通路的影響。結果如圖4所示，咖啡因能夠顯著降低UV照射引起的MAPKs的磷酸化水平升高，同時顯著上調SIRT3的蛋白表達水平。與處理1相比，處理2的HaCaT細胞經過紫外線照射后，p-p38、p-ERK、p-JNK的磷酸化水平均有極顯著或高度顯著升高(P<0.01或P<0.001)；而與處理2相比，處理3和處理4的細胞內p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

MMP9是降解細胞外基質成分如彈性纖維等的重要蛋白酶。與處理1相比，處理2 HaCaT細胞內MMP9蛋白的表達水平極顯著增加(P<0.01)；而與處理2相比，處理3和處理4的細胞內MMP9蛋白顯著下降(P<0.05)。

SIRT3是線粒體抗氧化相關信號通路的重要調節蛋白。實驗顯示，與處理1相比，處理2 HaCaT細胞內SIRT3蛋白表達極顯著降低(P<0.01)，Acetyl-p53蛋白高度顯著增加(P<0.001)。與處理2相比，處理3和處理4的細胞內SIRT3蛋白表達極顯著增加(P<0.01)；與處理2相比，Acetyl-p53蛋白表達水平處理3顯著降低(P<0.05)、處理4高度顯著降低(P<0.001)。據此表明，咖啡因可通過影響SIRT3/MAPKs信號通路，對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷起保護作用。

3 討 論

長期過量的日光照射是引起多種皮膚疾病的基本原因，也是誘發多種惡性或良性腫瘤的重要因素之一。研究表明日光中UVB引起的表皮細胞損傷與氧化應激有關，當細胞處于氧化應激狀態時會引起HaCaT細胞內ROS的產生和積累，導致皮膚外觀損傷甚至皮膚病[26]。過多的ROS是導致氧化損傷的主要原因，它可以直接或間接作用于細胞內的大分子或細胞器致使細胞損傷[27-28]。

通過UV照射HaCaT細胞建立氧化應激模型。結晶紫染色實驗結果表明，UV照射能降低HaCaT細胞的存活率。在UV照射前1 h對HaCaT細胞進行預處理，考察不同濃度的咖啡因對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用。結果表明，咖啡因能增加UV照射后HaCaT細胞的存活率。

正常生理情況下，活性氧的含量與機體抗氧化能力處于平衡，但在UV刺激狀態下，HaCaT細胞內氧化還原穩態被打破，細胞質和線粒體內活性氧含量增加，引起氧化損傷。通過實驗顯示，咖啡因可降低HaCaT細胞內和線粒體中活性氧的積累，顯現咖啡因可在通過減少細胞內ROS的積累、緩解氧化應激增強細胞的存活率起到對UV誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用，這對咖啡因在皮膚抗氧化產品中的應用提供了理論依據。

活性氧在細胞內信號傳導過程中具有重要作用，正常狀態下活性氧可以促進細胞增殖更新，而氧化應激狀態下，過多的活性氧使胞內許多大分子物質發生過氧化，激活下游信號通路造成細胞損傷[29-31]。已有研究表明，咖啡因能夠通過調節SIRT3/MAPK信號通路，緩解APPH誘導的氧化損傷[15]。為了探究咖啡因對UV誘導的氧化損傷的作用機制，通過蛋白質免疫印跡檢測了MAPKs通路中p-p38、p-JNK以及p-ERK的磷酸化水平。實驗結果表明，紫外線照射后，處理2的HaCaT細胞內MAPKs(p-p38、p-JNK和p-ERK)的磷酸化水平升高；使用不同濃度的咖啡因對細胞進行處理后，p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白表達降低，說明咖啡因對UV誘導的HaCaT氧化損傷的保護作用是通過降低MAPKs的磷酸化完成的。同時，UV照射會引起HaCaT細胞線粒體內SIRT3蛋白的表達降低，Acetyl-p53蛋白增加；處理3和處理4的細胞內SIRT3蛋白表達高于處理1，Acetyl-p53蛋白表達水平則降低。此外，與處理2相比，處理3和處理4的HaCaT細胞中，MMP9的蛋白表達水平降低。這些結果表明，咖啡因可以影響氧化應激過程中SIRT3/MAPKs信號轉導通路，進而對UV照射的HaCaT細胞產生保護作用。

4 結 論

咖啡因可以保護UV誘導的HaCaT細胞，減少其氧化損傷，這是通過調節SIRT3/MAPKs/ROS途徑完成的。該研究結果為含咖啡因的植物資源的綜合開發利用提供了實驗依據，也為咖啡因通過抗氧化機制來緩解UV誘導的損傷奠定了理論基礎。