狹小空間法構建抑郁癥大鼠模型的優劣探索*

閆雪, 曾德浩, 李超群, 張毅靖, 祝赫, 唐洪梅

1廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥學部(廣東廣州 510405)； 2南方醫科大學中醫藥學院(廣東廣州 510515)

抑郁癥是一種嚴重的精神疾病，以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征，給個人、家庭以及社會帶來巨大壓力和沉重的負擔。世界衛生組織(WHO)預測抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病。近年來，國內外眾多學者對抑郁癥的基礎或臨床開展研究，使其成為醫學研究的熱點之一。因此，穩定、易于操作的抑郁癥動物模型制備方法是這些研究的基礎和關鍵。2019年，中華中醫藥學會中藥實驗藥理專業委員會起草并公布了《抑郁癥動物模型制備規范(草案)》[1](以下簡稱“草案”)。該草案基于對現有抑郁癥動物模型大量實驗研究，總結了6類抑郁模型，其中有藥物、手術和慢性不可預知應激刺激結合孤養等多種不同的方式。慢性不可預知應激刺激結合孤養模型是近年來廣受關注的一種抑郁癥研究模型，其疾病發生和表現形式更符合人類的發病原因，可模擬人類的抑郁癥狀及一系列抑郁后生物化學改變，已被廣泛應用于抑郁癥研究領域[2]。但該方法存在耗時較長，勞動量大，結果不穩定，難重復的問題。特別是造模的強度和時間難以掌握，實驗組動物如所受刺激過于強烈，動物會對應激產生耐受或者動物變得異?？裨辏蝗缢艽碳み^于溫和，動物則不易產生抑郁樣行為[1]。本研究自2019年7月至2020年4月，模擬抑郁癥發病的刺激因素，創新性地嘗試一種新的造模方式，亟待能通過容易操作的刺激方式構建耗時短、勞動量小、易控制刺激強度的抑郁癥大鼠模型，且有與經典方法相同的造模效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級SD雄性大鼠30只，體重(250±20)g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCK(粵)2013-0034。水合氯醛(廣州中醫藥大學第一附屬醫院，20190901)，4%多聚甲醛(上海生工，E672002)、RIPA蛋白裂解液(廣州杏海生物，GB20173)、HE染色相關試劑(珠海貝索，EA-50)、冰凍切片機(leica，CM1950)、ELISA試劑盒[5-羥色胺(5-HT)](南京建成，H104)，自制曠場反應箱。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模方法 將大鼠30只常規飼養1周，后隨機分為3組，正常對照組、慢性溫和不預知應激模型組(CUMS組)和狹小空間模型組(M組)10只。正常對照組大鼠常規飼養。CUMS組采用應激方式如下：禁食24 h/次、禁水24 h/次、鼠籠傾斜30°過夜/次、潮濕飼養過夜/次、4℃冰水游泳5 min/次、晝夜顛倒/次、夾尾1 min/次，采用隨機數字表法每天隨機予2種應激。造模4周。M組大鼠單獨飼養于10 cm×10 cm×5 cm的狹小孤籠中，給予正常飲食，連續造模4周。

1.2.2 體重測定 各組大鼠在0、7、14、21、28 d測量體重。

1.2.3 飲水及攝食量測定 各組大鼠在0、7、14、21、28 d測量飲水及攝食量。測定前于0 h稱量并記錄水瓶及飼料的重量，24 h內大鼠自由飲水進食，24 h后再次稱量并記錄水瓶及飼料的重量，計算飲水及飼料的消耗量。

1.2.4 糖水偏好試驗 各組大鼠在0、7、14、21、28 d進行1次此試驗。試驗前禁食、禁水12 h，試驗時，首先將各組大鼠孤籠飼養，然后每籠放置2個裝有2%蔗糖水的小瓶，12 h后換為每籠2%蔗糖水和飲用水各1瓶，2 h后取走所有小瓶并稱重，計算糖水、飲用水和總液體消耗量以及糖水偏愛百分比。

1.2.5 曠場試驗 大鼠曠場反應箱100 cm×100 cm×35 cm，內壁涂黑，底面平均分為25個20 cm×20 cm小方格，曠場正上方2 m處架一數碼攝像頭，其視野覆蓋整個曠場。試驗時將大鼠放置于清潔敞箱中央，每次錄像時間5 min，然后人工計算大鼠直立次數和穿格次數，各組大鼠在0、14、28 d各試驗1次。

1.2.6 HE染色檢測 用水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛全身灌注，取海馬組織使用酒精梯度脫水、石蠟包埋和冰凍切片。將制好的切片脫蠟至水，逐步完成染色、脫水、透明、封固后，進行鏡下觀察。

1.2.7 ELISA法檢測海馬組織5-HT含量 海馬組織使用RIPA蛋白裂解液勻漿提取蛋白備用，按照ELISA試劑盒提供的實驗步驟進行操作檢測。

1.3 指標分類及量化評分[1]

1.3.1 表觀指標 Ⅰ類指標(核心指標)：動物的體重、偏好、活動性、食欲等是該模型重要的表觀指標。模型制備成功后，體重減輕、興趣索然、活動性顯著降低、食欲下降。表觀指標在抑郁癥模型的評價中占有重要地位，根據表觀指標的特點評分，正常得0分，異常得1分。

1.3.2 生化指標 Ⅱ類指標(直接相關指標)：目前，抑郁癥的病因并不清楚，發病機制比較復雜，多數學者將其歸因于單胺類神經遞質假說，其認為5-HT的含量降低是抑郁癥的重要生化指標。5-HT含量正常得0分，異常得1分。

1.3.3 病理學指標 Ⅲ類指標(間接相關指標)病理學指標不是臨床診斷的內容，主要是模型研究時體現。對腦組織的組織形態的變化是抑郁癥模型組織病理變化研究的重點。腦組織的神經元細胞數目正常，形態整齊，包漿豐富，排列規律整齊得0分；神經元細胞數目減少，形態不整齊，包漿固縮，排列無規律、較紊亂得1分。

1.3.4 指標分類及量化評分 將以上指標進行分類，并確定各類權重系數。草案對表觀指標中的7項小指標進行了評分，而本研究僅對其中5項進行評分，因此Ⅰ類指標權重系數僅為原草案表觀指標評分權重系數的5/7為標準進行評分。見表1。

表1 指標分級

2 結果

2.1 體重變化 0、7 d 3組大鼠的體重差異均無統計學意義(P>0.05)；14 d，CUMS組、M組大鼠的體重與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，且CUMS組與M組大鼠的體重差異有統計學意義(P<0.05)；21 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比體重差異均有統計學意義(P<0.01)；28 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比體重差異均有統計學意義(P<0.01)；21 d、28 d CUMS組與M組大鼠的體重差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠體重情況

2.2 狹小空間模型大鼠飲水及進食量變化 兩組大鼠在0 d的飲水和進食量差異無統計學意義(P>0.05)。但在造模7 d時，M組大鼠的飲水量明顯減少，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，CUMS組雖然飲水量減少，但與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模7 d時，CUMS組、M組與正常對照組比較進食量減少并差異有統計學意義(P<0.01)。14、21、28 d，CUMS組、M組與正常對照組比較飲水量及進食量均減少并差異有統計學意義(P<0.05、P<0.01)。見表3～4。

表3 大鼠飲水量情況

2.3 狹小空間模型大鼠糖水偏好度變化 0、7 d 3組大鼠的糖水偏好百分比差異均無統計學意義(P>0.05)；14 d M組大鼠的糖水偏好百分比與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；21、28 d CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比差異均有統計學意義(P<0.01)；0、7、14、21、28 d CUMS組與M組大鼠的糖水偏好百分比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 大鼠進食量情況

表5 造模不同時間糖水偏好百分比

2.4 曠場實驗 0 d 3組大鼠的直立次數與方格間穿越次數差異均無統計學意義(P>0.05)。7 d CUMS組與正常對照組相比直立次數差異無統計學意義(P>0.05)，方格間穿越次數差異有統計學意義(P<0.05)；M組與正常對照組相比直立次數和方格間穿越次數差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，M組與CUMS組相比直立次數差異無統計學意義(P>0.05)，方格間穿越次數差異有統計學意義(P<0.05)。14、21、28 d，CUMS組、M組大鼠與正常對照組相比，直立次數與方格間穿越次數差異均有統計學意義(P<0.01)。14、21 d, CUMS組與M組大鼠相比直立次數與方格間穿越次數差異均有統計學意義(P<0.01)；28 d, CUMS組與M組大鼠相比直立次數及方格間穿越次數差異均有統計學意義(P<0.05、P<0.01)。見表6～7。

表6 曠場實驗中大鼠直立次數 次

表7 曠場實驗中大鼠方格間穿越次數 次

2.5 狹小空間模型大鼠海馬組織病理變化 正常對照組大鼠海馬組織細胞結構正常，排列整齊，形態完整。CUMS組及M組大鼠海馬組織呈現彌散性損傷，神經元細胞數目較少，形態不整齊，包漿固縮，排列無規律、較紊亂。見圖1。

注：A：正常對照組；B CUMS組；C：M組

2.6 狹小空間模型大鼠血清中5-HT含量變化 正常對照組、CUMS組和M組的5-HT水平分別是983.21±54.18、353.67±25.33和365.23±23.54。與正常對照組比較，CUMS組及M組大鼠海馬組織5-HT水平顯著降低(P<0.01)，且CUMS組與M組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.7 模型制備評判標準 CUMS組與M組抑郁癥模型得總積分>0.5，提示模型制備成功。見表8。

表8 各組模型的量化評分 分

3 討論

全世界約有3.5億人飽受抑郁之苦，中國的抑郁癥發病率約為3.02%，據估計真實的數據可能遠遠高于這個數字[3]。然而，目前人類對于抑郁癥的病因和發病機制仍未完全明確。其機制的研究和藥物的研發必須首先建立在比較理想的抑郁癥動物模型上。目前已經用于構建的抑郁癥大鼠模型的大鼠主要有天生對應急敏感的WISTAR KYOTO(WKY)大鼠[4]、具有遺傳抑郁基因的Flinder Resistant Line(FSL)大鼠[5]、Sprague dawley(SD)大鼠[6]、天生嗜酒的Fawn Hooded(FH)大鼠[7]和腦內5-HT活力低下的Tryon Maze Dull(TMD)大鼠等；每種大鼠模型均具有自己的優缺點[2]。然而目前還并沒有一個動物模型能夠完全涵蓋所有的抑郁癥狀。因此，可以聯用多種造模方法以建立較為全面、與人類抑郁癥狀更為相似的動物模型，從而提高實驗結果的可信度。

一個理想的抑郁癥動物模型應該具有良好的表觀信度、內在信度和預測信度；也就是動物行為特點和人抑郁癥癥狀相似，動物模型的病理生理機制與人類相同，人類有效抗抑郁藥物對動物有效[8]。目前抑郁癥動物模型的觀測指標[1]主要包括：表觀指標、生化指標、病理學指標。表觀指標為Ⅰ類指標(核心指標)，模型制備成功后，動物有食欲下降、體重減輕、活動性顯著降低等表現。抑郁癥的病因并不清楚，發病機制比較復雜，多數學者將其歸因于單胺類神經遞質假說，因此認為5-HT失常是抑郁癥的生化基礎之一。臨床診斷不使用病理學指標作為抑郁癥診斷的指標，該指標主要用于對動物模型的研究中。

抑郁癥動物模型制備規范草案提示，研究者應根據各類指標對抑郁癥模型的貢獻不同進行分級，盡量將單純的定性描述轉變成可量化或半量化的指標，提高判定的可控性。抑郁癥模型每次造?？赡軙霈F不同的總積分，總積分可以有20%左右的偏差，所得總積分應>0.5，則可認為該模型制備成功。本研究參考了草案所采用的計算方法及三類指標的權重分值，同時也按草案建議根據不同制備模型方法及所觀測指標的不同對計算方法進行了適當調整。

本研究分別從生理及行為學指標、生化指標、病理學指標這3個方面驗證狹小空間大鼠抑郁癥模型。與正常對照組相比，M組的表觀指標包括體重、飲水量、進食量、糖水偏好度、活動行為均明顯降低，海馬組織中5-HT的含量顯著下降，且組織呈現彌散性損傷，在這三方面均達到了造模的要求。而本模型造模僅需要將體重在規定區間范圍內的大鼠飼養在孤立與狹小的鼠籠中，使其雖能正常飲水進食但行為上的自由活動受限，操作簡便，不會導致動物死亡或過于煩躁攻擊實驗人員。相較于經典的慢性CUMS[9]，本造模方法的優點在于：便于操作，重復性強，不損失實驗動物。慢性不可預見應激模型可模擬生活中遇到的各種刺激因素，造成動物心理上的抑郁。CUMS模型刺激方法[10]包括：禁水、禁食、夾尾、冰水游泳、鼠籠傾斜、日夜顛倒等不下10種，3～4周內每天隨機給予1種刺激，使動物無法預料給予何種刺激從而避免適應。此種模型制備方法復雜多樣，操作相對繁瑣，重復性差，工作量大[11]，時間成本高，重復性、可靠性差[12]。刺激方法中的冰水游泳易使動物因低溫死亡，夾尾刺激易使動物過于煩躁攻擊實驗人員。CUMS模型可以根據研究目標藥物的可能作用機制、藥物起效快慢或療程來確定CUMS周期和適宜的給藥時間。也因此，CUMS模型存在幾方面問題：應激項目沒有公認的選擇方案，應激的操作順序沒有統一規范，各應激的刺激強度沒有統一標準，各應激操作時間安排未作詳細敘述等，認為，未來CUMS模型的發展需要將上述幾方面考慮在內，更嚴格規范CUMS操作規程，是保證模型穩定性和可復制性的重要前[13]。

總之，本研究采用狹小空間方法成功構建抑郁癥大鼠模型(M)，并且本模型能夠縮短抑郁癥模型的成模時間。方法簡便、穩定、省時和造模效果好，為抑郁癥模型大鼠模型的構建提供一種安全有效的新方法。