基于基因組高通量測序的腦膠質瘤組織中差異表達長鏈非編碼RNA篩選及驗證

高元峰，王瑞穎，易柳，李珊，肖望重

1湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙410007；2湖南中醫藥大學

膠質瘤為中樞神經系統常見的原發性惡性腫瘤之一［1］，其發病年齡多見于20～50歲，以30～40歲為最高峰，另外在10歲左右兒童中亦較多見。患者多表現為頭痛、惡心嘔吐、癲癇、視物模糊等癥狀，嚴重可導致死亡。臨床上，膠質瘤以星形細胞瘤最為常見，其次是多形性膠質母細胞瘤和室管膜瘤［2-3］。2016版WHO中樞神經系統腫瘤分類標準引入了分子學特征，構建了分子時代中樞神經系統腫瘤診斷的新理念［4］。然而目前作為診斷的特定基因數量有限，如p53、IDH-1、GFAP、EGFR等，未知且重要的基因靶點仍有待開發，探討新的分子靶標是膠質瘤基礎研究和臨床治療的新契機。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究顯示，在多種細胞生理過程中，lncRNA與關鍵組件的基因或蛋白質相互作用，改變基因表達或蛋白的一級或二級結構，從而導致腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移［5-7］。目前共有20多個異常表達的lncRNA被證實與膠質瘤的發生發展密切相關，如HOXA11-AS、Linc-POU3F3和HULC等［8-9］，然而還有許多未知的lncRNA及其功能尚未明確。本研究采用高通量測序法篩選膠質瘤組織與正常腦組織中存在差異表達的lncRNA，并進一步擴大樣本進行驗證，旨在尋找新的膠質瘤生物標志物，為膠質瘤的早期診斷和治療提供新的靶標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月—2019年12月在中南大學湘雅附屬腫瘤醫院行手術切除的89例腦膠質瘤患者的膠質瘤組織，25例腦外傷患者的腦組織樣本。納入標準：藥物治療前未進行過放療或生物療法的膠質瘤患者及腦外傷患者。排除標準：伴有非神經系統的惡性腫瘤；合并肝、腎、造血系統等嚴重原發性疾病及心血管疾病；肝腎功能不全；懷孕或哺乳期婦女。本研究經臨床倫理機構審查委員會審核并批準（注冊號：ChiCTR1800019217）。

1.2 腦膠質瘤組織中lncRNA高通量測序 采用LncRNA-Seq基因組高通量測序法。取19例腦膠質瘤組織和5例腦外傷組織，提取組織總RNA，去除rRNA。制備缺失rRNA的RNA特異性文庫。使用隨機引物、逆轉錄酶、DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成cDNA。將DNA片段腺苷酸化后，進行雜交，用Ampre XP系統（Beckman Coulter，Beverly，MA）純化文庫片段，再利用Illumina HiSeq進行雙端測序，測序工作由北京博奧生物技術有限公司完成。

1.3 腦膠質瘤組織中差異表達lncRNA的篩選 應用edgeR軟件分析膠質瘤組織與腦外傷組織差異表達的lncRNA，獲得P值后進行兩輪多重假設檢驗校正，通過控制錯誤發現率（FDR）來決定P值的閾值，校正后的P值即Q值。采用FPKM公式計算差異倍數（FC）。以P<0.05、FC≥2或≤0.5為標準，篩選差異表達的lncRNA。計算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對差異lncRNA進行聚類，以聚類圖進行展示。將篩選出的差異表達lncRNA以火山圖的形式進行可視化。

1.4 腦膠質瘤組織中差異表達lncRNA的驗證 采用qPCR法對上述篩選出的部分差異lncRNA進行驗證。選取膠質瘤組織70例和正常腦組織20例，加入TRIzol試劑提取總RNA，采用超微量核酸分析儀（NANODrop2000，日本島津公司）測定RNA濃度和純度，滿足A260/A280在1.8～2.0。以提取的RNA為模板，逆轉錄合成cDNA，使用實時熒光定量PCR儀（7300 plus，美國ABI公司）進行實時定量擴增。SYBR反應體系（20μL）：gDNA 10.0μL，5×Prime script Buffer 4.0μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0μL，RT primer Mix 1.0μL，RNase free H2O補足至20μL。反應條件：95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。取所有樣本最終Ct值的平均值。根據熔解曲線分析引物的特異性，以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料先行正態性檢驗，符合正態分布的采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的采用非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織中差異表達lncRNA的篩選結果 根據高通量測序結果，基于lncRNA表達矩陣，繪制聚類圖，見OSID碼。橫坐標代表不同分組，N為腦外傷組織，T為腦膠質瘤組織；紅色表示該lncRNA含量高表達，藍色表示該lncRNA含量低表達。結果表明兩組lncRNA表達存在明顯差異。為將差異lncRNA可視化，以FC變化為橫坐標，以P值變化的統計學意義為縱坐標，按前述差異基因篩選條件（P<0.05、FC≥2或≤0.5），繪制火山圖，見OSID碼。與腦外傷組織相比，膠質瘤組織中存在明顯差異表達的lncRNA共3 040個，其中表達上調1 233個、表達下調1 807個。差異表達的lncRNA按FC排序，前10位分別見表1。

2.2 腦膠質瘤組中中部分差異表達lncRNA的驗證結果 對腦膠質瘤組織中表達上調和下調前3位的lncRNA進一步擴大樣本量進行驗證，PCR引物設計序列見表2。結果顯示，與正常腦組織比較，腦膠質瘤組織中TCONS_00 0 1 09 6 1、ENST 0 0 0 00 4 4 35 4 6.1、ENSG00000262119.1表達升高，ENST00000531508.1、TCONS_00004034、ENST00000504876.1表 達 降 低（P<0.05或<0.01），與基因組高通量測序結果一致。見表3。

表1 腦膠質瘤組織中差異表達的lncRNA（前10位）

表2 lncRNA引物序列（5'→3'）

表3 部分差異表達lncRNA的驗證結果

3 討論

非編碼RNA指的是不編碼蛋白質的RNA，大部分屬于“管家RNA”或“監管RNA”。非編碼RNA與疾病的發生發展密切相關，尤其在腫瘤的預測、診斷及治療預后等方面具有重要價值，成為近年來國內外研究的熱點之一［10-12］。lncRNA是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其功能主要涉及以下4個方面：①表觀遺傳調控：如lncRNA ZEB1-AS1啟動子區具有低甲基化現象［13］；lncRNA Xist能促進染色質修飾復合物的表達［14］；lncRNA HOTAIR能調整母體基因HOXD在HOXD基因簇的空間位置［15］。這些表觀遺傳調控能直接或間接影響腫瘤發生發展。②基因轉錄水平調控：如lncRNA TSLC1-AS1能與其母體的TSLC1 mRNA形成復合體，增加母體mRNA的穩定性，避免被酶解，從而影響TSLC1蛋白表達［16］。③蛋白水平調控：非編碼RNA不具有編碼蛋白的能力，但可以調控某些蛋白的活性。如lncRNA FOXD1-AS1能結合到eIF5a蛋白的特定結構域，影響其活性，從而影響eIF3a蛋白的表達水平［17］。④miRNA競爭調控：如lncRNA TUG1的功能與miR-21有關，并通過lncRNA-miRNA-mRNA軸發揮作用［18-19］。

本研究通過基因組高通量測序方法，篩選出膠質瘤組織中差異表達的lncRNA共3 040個，其中表達上調1 233個、表達下調1 807個。這些差異表達的lncRNA可能與膠質瘤的發生發展有一定關聯。為了驗證基因組高通量測序結果，我們進一步擴大了樣本量，利用qPCR法檢測腦膠質瘤組織與正常腦組織中TCONS_00010961、ENST00000443546.1、ENSG0 0 0 0 02 6 2 11 9.1、ENST 0 0 0 00 5 3 15 0 8.1、TCONS_00004034、ENST00000504876.1的表達情況，結果顯示腦膠質瘤組織中前3個lncRNA表達顯著升高、后3個lncRNA表達顯著下降，與測序結果一致。

綜上，本研究利用基因組高通量測序初步篩選出膠質瘤組織中差異表達的lncRNA，并進一步擴大樣本進行驗證，二者結果相符。本研究發現了更多未知的與膠質瘤發生發展相關的lncRNA，但作為臨床標志物可能還存在一定的局限性，無法真正應用于臨床，且不同地區、不同種族之間是否具有同樣的差異尚未可知。下一步我們將從細胞凋亡、自噬等方面進行膠質瘤細胞實驗，尋找與lncRNA相關的miRNAs以及相關靶基因。