豁痰解毒通絡飲對大鼠頸總動脈球囊損傷后血管內膜增生的影響及作用機制研究

田騰輝，鄧 悅，常立萍，石 銳，于克英，張 淼，邵 笑

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021）

動脈粥樣硬化（AS）是冠狀動脈性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）關鍵的病理基礎。近年來，內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）及其誘導的自噬（autophagy）被證實是多種疾病發生發展中共有的機制[1-3]。研究[4]表明，適度ERS 引起的自噬可協同減輕內質網負荷，抑制ERS 過度激活，具有抗AS作用，而持續的ERS 可過度激活自噬，導致EC 功能紊亂及炎癥的產生，加速血栓形成[5]。本研究通過建立大鼠頸總動脈球囊損傷模型，探討豁痰解毒通絡飲抑制PCI 術后再狹窄的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF 級SD 大鼠40 只，體質量（380±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司[許可證號：SCXK（遼）2015-0001]。環境為晝夜節律，室溫條件（27±2）℃，濕度條件（37±5）%。

1.2 實驗藥物 中藥復方豁痰解毒通絡飲（全瓜蔞20 g，當歸15 g，丹參15 g，紅景天15 g，金銀花30 g等），購自長春中醫藥大學附屬醫院新綠色顆粒藥房；阿托伐他汀鈣片（20 mg），購自輝瑞制藥有限公司（國藥準字H20051408）。

1.3 主要實驗試劑與儀器 實驗試劑：RIPA 裂解液，碧云天生物技術公司；Trizol，Thermo Fisher Scientific；免疫組化超敏試劑盒（KIT-9710），福州邁新生物技術開發公司；兔源一抗，均購于CST 公司；辣根過氧化物酶二抗（羊抗兔，SA00001），購于Proteintech公司；總RNA提取試劑盒（9767）、DNA轉錄試劑盒（RR047A）均購自Takara 公司。實驗儀器：2F Fogarty 冠狀動脈擴張球囊，美國Edwards Lifescience 公司；Mini Protean 蛋白電泳儀（PowerPacTMHC）；實時熒光定量PCR 儀（CFX connect），美國伯樂公司；智能成像系統（iBright FL1000）。

1.4 動物分組及模型建立

1.4.1 分組 40 只SD 雄性大鼠隨機分為假手術組、球囊損傷組、豁痰解毒通絡飲組、阿托伐他汀組，每組10 只。治療組分別予豁痰解毒通絡方（6.67 g·kg-1·d-1）、阿托伐他汀（1.19 mg·kg-1·d-1）灌胃，其余組均以等體積生理鹽水灌胃。術前12 h 禁食不禁水，均皮下注射低分子肝素鈉。

1.4.2 球囊損傷模型 1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射，麻醉滿意后將大鼠固定于動物臺，備皮、消毒后沿頸部正中切開皮膚，依次鈍性分離至左側頸總動脈，使用微型血管夾夾閉頸內動脈和頸總動脈近心端，4.0 縫合線結扎頸外動脈遠心端，眼科顯微剪于頸外動脈近心端附近45°剪“V”形開口，插入球囊導管，向近心端緩慢送入球囊約3 cm，以3.0～5.2 atm 壓力擴張球囊并旋轉退至切口，反復3 次以達到剝脫內膜的目的。術后結扎切口近心端，松開微型血管夾，觀察血流恢復及出血情況，依次縫合切口。假手術組僅分離頸動脈。

1.5 蘇木素-伊紅染色 取損傷段頸總動脈約2～3 cm，浸入4%多聚甲醛溶液固定，經透明、脫水、包埋、切片、HE 染色等病理學操作，光微鏡下觀察并拍照。使用Image J 軟件計算內膜面積（area of intima,IA）和中膜面積（area of membrane,MA），并計算比值。

1.6 免疫組織化學法檢測GRP78 表達情況 按照免疫組化試劑盒（邁新9710）進行染色。將石蠟包埋切片脫蠟及水化后，經微波抗原修復、滅活、封閉、顯色、復染等步驟后，將切片置于光鏡（×100）下觀察。以胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達。

1.7 蛋白質免疫印跡試驗檢測大鼠頸總動脈中 IRE1α、XBP1、ATG5 蛋白表達水平 將損傷動脈段液氮研磨后加入RIPA 裂解液充分裂解，4 ℃，12 000 r/min離心15 min 取上清，使用超敏BCA 試劑盒測定并調平各組總蛋白濃度。上樣量為每槽60 μg，配制10%或12%分離膠，濃縮膠為5%。電泳參數：一階段為70 V，30 min，二階段為140 V，50 min；甲醇預先5 min 活化PVDF 膜，15 V，300 mA，1 h 轉膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗（1:2 000）搖床過夜，后經二抗（1:2 000）孵育1～2 h；超敏ECL 試劑盒顯色，成像儀拍照后存儲為TIF 格式。使用Image J 軟件帶進行灰度值分析，目的蛋白均以GAPDH 為內參。

1.8 實時熒光定量PCR 檢測大鼠頸總動脈組織中XBP1、ATG5 mRNA 的表達情況 損傷段頸總動脈液氮研磨后，按照TAKARA（9767）試劑盒步驟提取Total RNA，鑒定其純度及濃度，合格后反轉錄為cDNA（37℃，15 min；85℃，5 s，4℃）。采用25 μL反應體系進行qPCR 反應，條件為95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，30 s，40 個循環。將目的基因CT 值按2-△△CT法進行表達量計算。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.9 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，所得結果采用均數±標準差（）表示，單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 豁痰解毒通絡飲對大鼠球囊損傷血管重構的影響 HE染色結果顯示，假手術組內皮形態完整且光滑，排列均勻規律，由一層扁平血管內皮構成；球囊損傷組內膜細胞較為致密且排列紊亂，新生內膜導致壁層顯著增厚，I/M 顯著高于假手術組（P＜0.01）；與球囊損傷組比較，各治療組新生內膜厚度均明顯降低，管腔狹窄程度顯著減輕，I/M 比值小于球囊損傷組但大于對照組（P＜0.05）。見圖1，表 2。

圖1 各組大鼠頸總動脈病理變化（HE，×100)

表2 各組大鼠頸總動脈內膜增生情況（，n =10）

表2 各組大鼠頸總動脈內膜增生情況（，n =10）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與球囊損傷組比較，△P ＜0.05

2.2 豁痰解毒通絡飲對大鼠增生內膜中GRP78 蛋白表達水平的影響 GRP78 在胞核中幾乎不被染色而呈藍色顆粒，但其活化后進入細胞核，可出現棕黃顆粒的核染色，故胞核呈現棕黃色顆粒則說明GRP78 陽性表達。結果顯示，與假手術組相比，球囊損傷組新生內膜中出現大量棕黃色顆粒，呈現出過表達；與球囊損傷組相比，豁痰解毒通絡飲組和阿托伐他汀組新生內膜中胞核多為藍色，僅見少量棕黃色顆粒。見圖2。

圖2 各組大鼠增生內膜GRP78 蛋白的表達水平（IHC，×100）

2.3 豁痰解毒通絡飲對大鼠增生內膜中IRE1α、XBP1、ATG5蛋白表達水平的影響 與假手術組比較，球囊損傷組IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）；與球囊損傷組比較，豁痰解毒通絡飲組和阿托伐他汀組IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 豁痰解毒通絡飲對大鼠增生內膜中IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表達的影響（，n=10）

2.4 豁痰解毒通絡飲對XBP1、ATG5 mRNA 表達水平的影響 與假手術組比較，球囊損傷組XBP1、ATG5 mRNA 的表達量顯著升高（P＜0.01）；與球囊損傷組比較，各給藥組明顯降低XBP1、ATG5 mRNA 的表達水平（P＜0.01）。見圖4。

圖4 豁痰解毒通絡飲對XBP1、ATG5 mRNA 表達水平的影響（，n=10）

3 討論

內質網（ER）是細胞內蛋白質合成、折疊以及修飾的重要細胞器，也是脂質合成和鈣存儲的重要場所。應激環境下，ER 功能失調可觸發內質網應力，進而激活未折疊蛋白質反應（UPR）以期恢復ER 的穩態。UPR 的激活存在3 條信號轉導途徑：肌醇需求酶-1（IRE1）、淀粉內質網激酶（PERK）及活化轉錄因子6（ATF6）途徑[6]，這些途徑可根據ERS 的強度、持續時間以及細胞類型促進細胞適應性存活或凋亡[7]。研究發現，適度的自噬是細胞應對UPR 的一種自我保護機制，通過對ER 中堆積的蛋白進行降解以減輕ERS[8]。GRP78 是UPR 應答的主體，作為分子伴侶可介導新生蛋白質的正確折疊和裝配。GRP78 正常以非活性形式與ATF6、PERK 和IRE1 結合，作為UPR 跨膜應力傳感器，ERS 發生時，GRP78 被激活并解離，啟動UPR 調節的相關降解程序[9]。IRE1α-XBP1通路是ERS 與自噬相關聯的重要調控通路。IRE1α 與GRP 78 以非活性狀態結合，當IRE1α 激活后具有了核酸內切酶活性，可破壞mRNA 內含子的24 個堿基片段，并編碼X-box 結合蛋白1（XBP1），加強對堆積蛋白的降解，但XBP1 的過度表達會損害細胞，促進AS 的形成[10]。有研究表明，IRE1α-XBP1 可通過增強Beclin-1 的轉錄水平正向調控自噬[11]，當ERS 負荷超載時，ATF4 可誘導自噬啟動因子Beclin-1、ATG5、ATG12 等信號的激活，影響著AS 的進展[12]。

隨著PCI 治療的普遍開展，中醫學者不斷融合了現代醫學理論，豐富和發展了PCI 術后再狹窄的病因病機學說。最新診療指南[13]指出，本病虛證以臟腑氣血陰陽虧虛為主，標實以血瘀、痰阻、氣滯、寒凝多見，并將復合證型分為氣虛血瘀證、痰瘀互阻證和熱毒血瘀證。

豁痰解毒通絡飲是鄧悅根據多年的中醫臨床實踐凝練出的中藥方劑，其選藥考究、藥味精練、配伍得當，在臨床及科學研究中均證實有良好療效[14-15]。鄧悅[16]認為，PCI術后再狹窄的病機為“痰瘀伏絡、蘊結成毒”。隱而不發是伏邪從侵入人體到疾病發作之前的狀態特征，此時PCI 治療的血管內膜段在原有AS 的基礎上繼發炎性反應、血栓形成及內膜增殖、遷移等病理變化，使管腔逐漸狹窄；邪伏日久，多易暗耗正氣、損傷臟腑，又或伏邪熱化，加深毒性。鑒于本病的病機特點，我們以“豁痰解毒通絡”為治法，采用豁痰解毒通絡飲作為本研究的方劑，通過實驗研究探索其內在生物學機理。研究結果顯示，豁痰解毒通絡飲明顯抑制內膜增生，減輕管腔狹窄；并且下調大鼠頸總動脈損傷組織中內質網應激信號GRP78-XBP1-IRE1α的表達量，且降低自噬信號通路中ATG5 的表達量。我們推測，豁痰解毒通絡飲可能通過抑制大鼠頸總動脈損傷組織中內質網應激-自噬的過度激活來抑制內膜增生，從而達到治療再狹窄的目的。

越來越多的證據表明自噬發生在晚期AS斑塊中，是對抗ERS 的適應性反應。降低ERS 通路過表達，可減輕自噬的過度激活，從而延緩AS 的發生。本次實驗探究了豁痰解毒通絡飲的藥理作用機制，為其防治冠脈再狹窄提供了科學依據，但冠脈再狹窄發病機制復雜，在今后的研究中仍需多途徑、多維度地進行深入挖掘。