綠豆萌發期耐旱種質資源篩選評價和遺傳多樣性分析

黃年英，朱珍珍，劉昌燕，廖芳麗，李 莉，陳宏偉，劉良軍，韓雪松，萬正煌 ，沙愛華

（1. 長江大學農學院/主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，湖北 荊州 434025；2. 湖北省農業科學院糧食作物研究所/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；3. 荊州市種子管理局，湖北 荊州 434020）

0 引言

【研究意義】綠豆[Vigna radiata（L.）Wilczek]，屬菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna），是我國傳統的豆類食物，廣泛種植于華北、西北和東北等主產區及其他省份[1]，綠豆播種季節常因降雨量少而影響綠豆種子萌發，嚴重限制了綠豆生產的發展[2,3]。除了引水灌溉，篩選耐旱綠豆種質資源、培育耐旱品種是解決這一問題的根本途徑。萌發期是植株正常生長發育的關鍵時期，而土壤水分含量會直接影響種子萌發，因此萌發期是研究植物耐旱性的關鍵時期。對綠豆種質資源萌發期耐旱性進行評價及篩選耐旱種質，可為綠豆耐旱品種選育及品種改良提供參考[4]。【前人研究進展】近年來，綠豆種質篩選方面的研究已有較多報道，劉晨旦等[5]采用15% 的PEG-6000 高滲溶液對 58 份綠豆品種進行干旱模擬脅迫，測定其發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數和相對根長等指標，對不同基因型綠豆品種的耐旱性進行了鑒定，篩選出1份高耐和4份耐性品種。王蘭芬等[6]利用抗旱性系數、隸屬函數和抗旱性指數對綠豆的抗旱性進行評價，指出3種方法相關性極高，適宜于綠豆抗旱鑒定評價。Ali等[7]根據綠豆種子萌發特性與幼苗抗氧化潛能及養分吸收的關系，研究了不同綠豆品種的耐旱性。高運青等[8]運用灰色關聯度分析方法，對29份不同來源綠豆種質資源進行綜合評價，篩選出6份綜合性能較好的綠豆品種，并依據聚類分析將其資源聚為4 類。基于分子聚類的方法能夠準確揭示不同種質之間的遺傳關系，為應用不同種質開展相關育種提供參考，綠豆中也有較多研究報道。Sunayana等[9]對60份不同基因型綠豆在夏季限濕條件下的遺傳差異進行了評價，基于19個表型標記，層次聚類分析確定了9個大類，包含1～15個基因型。葉衛軍等[10]開發了274 2個SSR標記，通過聚類分析將90份材料分為2個類群，具有相同地理來源的材料多數可以聚在一起或成簇狀分布。趙雅楠等[11]利用 15 對SSR引物對東北三省地區 156 份綠豆種質資源進行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數為 0. 478 的閾值處將參試個體分為 5 個組群，相同地理來源品種大多成簇分布。【本研究切入點】前人研究雖然鑒定出了一些耐旱綠豆種質，但仍無法滿足生產需求。本研究擬通過評價收集的56份綠豆種質萌發期耐旱性，期望鑒定出新的耐旱綠豆種質，并明確其遺傳基礎，以滿足綠豆耐旱育種的需要。【擬解決的關鍵問題】以相對發芽率、相對發芽勢和相對根長等10個指標作為耐旱性評價指標，通過主成分分析、隸屬函數分析和多元分析方法鑒定綠豆種質耐旱性。基于SSR擴增對56份種質資源進行分子聚類，明確其遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的56份綠豆種質材料及來源地如表1所示，均 由湖北省農業科學院糧食作物科學研究所提供。

1.2 耐旱種質資源篩選試驗設計

1.2.1 試驗準備 選取優質、飽滿的種子在10%Naclo溶液中浸泡5 min，然后用無菌水洗滌3～4次。均勻擺入鋪有雙層濾紙的培養皿中，甘露醇處理和蒸餾水對照處理（CK）均3次重復，每個重復放25粒種子，用15 mL甘露醇溶液或蒸餾水浸潤，培養皿放置在人工培養箱黑暗發芽，溫度為25 ℃，每天定時補 充少量溶液或水。

1.2.2 耐旱性相關指標測定 從種子放置培養皿第2天開始每日定時統計發芽種子數。第8天從每個培養皿中隨機選取10株正常生長的幼苗測定其根長、芽長及其鮮重等指標，并計算平均值。發芽相關指標按農作物發芽技術規定（GB/T 35434 1995）測量計算，各指標公式如下：

相對發芽率（RGR，relative germination rate）=第8 d發芽種子數/供試種子數×100%

發芽率（GR，germination rate）=第8 d發芽種子數/供試種子數×100%

相對發芽勢（RGE，relative germination energy）=（處理發芽勢/對照發芽勢）×100%

發芽勢（GE，germination energy）=（第5 d的發芽種子數/供試種子數）×100%

表 1 56份綠豆材料編號及基本信息Table 1 Codes and basic information of 56 mung bean germplasms

相對根長（RRL，relative Root length）=（處理根長/對照根長）×100%

相對胚軸長（RPL，relative plumular axis length）=（處理胚軸長/對照胚軸長）×100%

相對芽長（RBL，relative bud length）=（處理芽長/對照芽長）×100%

相對芽干重（RSDW，relative shoot dry weight）=（處理芽干重/對照芽干重）×100%

相對芽鮮重（RSFW，relative shoot fresh weight）=（處理芽鮮重/對照芽鮮重）×100%

活力指數（VI，vigor index）=（相對苗高×相對發芽率）×100%

相對苗高（RBL，relative bud length）=（處理苗高/對照苗高）×100%

萌發耐旱指數（GDRI，germination drought tolerant index）=滲透脅迫下的萌發指數/對照萌發指數，萌發指數（GI，germination index）=（1.00）nd2+（0.75）nd4+（0.5）nd6+（0.25）nd8（其中，nd2、nd4、nd6、nd8分別為第2、4、6、8 d的種子發芽率，1.00、0.75、0.50、0.25分別為相應萌發時間所賦予的耐旱系數）

萌發脅迫指數（GSI，germination stress index）=處理種子發芽指數/對照種子發芽指數

發芽指數（GI，germination index）=?（DG/DT）（DG為逐日發芽數，DT為相應DG的發芽天數）

萌發耐旱性指數和萌發脅迫指數的計算方法參照 李玲等[12]的方法。

1.2.3 數據統計分析 采用Microsoft Excel 2010 進行數據統計、計算及隸屬函數分析，DPS 7.01 統計軟件進行數據相關性分析及主成分分析。相關公式如下：

式中，U（Xj）表示j指標的隸屬函數值，Xj為某個指標的實際測量值，Xjmax、Xjmin分別為該指標的最大值和最小值。

權重計算公式：

式中，Pj表示第j個綜合指標的貢獻率。綜合評價D值計算公式：

參考王利彬等[13]的大豆耐旱性鑒定方法，把耐旱級別劃分為5個等級：1級：D≥0.8，高耐；2級：0.6≤D＜0.8，耐；3級：0.4≤D＜0.6，中耐；4級：0.2≤D＜0.4，較敏感；5級：D＜0.2，敏感。

1.3 SSR試驗設計

1.3.1 DNA提取和PCR擴增 取室溫下種植的綠豆新鮮幼葉葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。并將DNA稀釋至50 ng·μL?1，選用34對SSR引物[14]對綠豆進行SSR標記分析（表2）。反應體系總體積為15 μL，包含 Taq聚合酶0. 2 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 0.4 μL，引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，ddH2O 10. 2 μL。PCR擴增在TGreat Gradient

表 2 用于遺傳多樣性分析的34對引物信息Table 2 Thirty-four pairs of primers used for genetic diversity analysis

Thermal Cycler OSE-GP-01型PCR儀上進行。反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，53～60 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后72 ℃終延伸10min。PCR產物用6.0% PAGE電泳分析，銀染后讀帶。每個基因座的等位基因數（Na）和多態性 信息含量（PIC值）均作為多樣性參數[15]。

1.3.2 數據統計分析 同一對SSR引物擴增帶（等位基因變異）在電泳板相同位置有帶記為 1，無帶記為0。使用PowerMarker 3.4計算遺傳多樣性參數。利用NTSYS-PC 2.1軟件生成遺傳相似系數，并進行聚 類分析。

2.1 10%的甘露醇溶液模擬干旱脅迫對綠豆種質耐旱性相關指標的影響

在10%甘露醇溶液和蒸餾水對照下測量56種綠豆種質的發芽指標（表3）。發芽勢為4.00%～88.00%，平均值為44.32%，較對照變化率為?54.12%；發芽率為28.00%～100%，平均為64.74%，變化率為?33.67%；其他發芽相關指標也表現出受到明顯抑制作用，芽鮮重變化率最大為?99.00%，其次為活力指數變化率為?96.81%，根長、胚軸長、芽長、芽干重、發芽指數、萌發指數變化率分別為?93.1%、?92.14%、?95.4%、?96.00%、?73.04%、?70.51%。因此，干旱脅迫對種子萌發的抑制作用體現在多個性狀，抑制程度也存在差異。比較處理組與對照組，處理組芽長與芽干重的變異系數分別降低14.29%和2.33%，其發芽勢變異系數增加9.52倍，胚軸長、萌發指數、發芽指數、發芽率、簡易活力指數、芽鮮重和根長分別增加9.00倍、7.20倍、5.67倍、0.84倍、0.78倍、0.53倍、0.36倍（表3）。

表 3 56份綠豆材料萌發期蒸餾水和10%甘露醇干旱脅迫下各指標的變化與比較Table 3 Evaluation indicators (mean+SD) on seeds of 56 mung bean germplasms germinated under water or 10% mannitol treatment

2.2 不同綠豆種質資源萌發期耐旱性評價指標的主成分分析

主成分分析獲得的前三個綜合指標的貢獻率分別為57.87%，16.42%和11.42%，累積貢獻率達85.71 %（表4），表明前3個相互獨立的主成分能夠代表10個指標的變異信息。將其命名為3個全新的相互獨立的綜合指標，順序定義為第 1、第2、第 3主成分（Comprehensive index，CI1、CI2和 CI3）。

2.3 不同綠豆種質資源萌發期耐旱性的綜合評價

在干旱脅迫處理，CI 1中種質No.3的 隸屬函數值U（Xj）最小，而No.13的 U（Xj）最大（表5）, 表明以 CI 1作為評價指標時，No.3和 No.13分別對干旱表現為敏感和高耐。根據主成分分析得到的各綜合指標貢獻率大小（表4），計算U（X）1、U（X）2和U（X）3的權重值Wj，分別為 0.675、0.192和0.133。進一步根據U（Xj）和相應Wj進行加權計算得到的綜合評價值D對56份種質耐旱性進行評價，發現No.13 的D值最大，而No.3的 D 值最小（表5），表明它們分別為最耐旱和最敏感種質。

2.4 耐旱性分類結果

根據各種質資源的綜合評價D值，按耐旱性分級標準將56個綠豆品種分為高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5個等級。其中中綠14號（No.13）和中綠17號（No.16）表現為高耐；10 份種質（No.01，08，18，20，21，22，37，40，48，52）表現為耐旱，占供試材料的17.86%；中耐種質30 份，分別為No.02，04，06，07，09，10，11，14，15，17，19，23，26，28，34，35，36，39，41，42，43，44，45，46，49，50，51，54，55和56，占供試材料的53.58%；敏感材料13份，分別為No.05，12，24，25，27，29，30，31，32，33，38，47和53，占供試材料的23.21%；高敏材料1份，為中綠3號（No.03）。

表 4 主成分分析Table 4 Results of principal component analysis

2.5 遺傳多樣性分析

利用SSR標記研究遺傳多樣性，等位基因數為2～12個，平均等位基因數為5.5個，PIC值的變幅為0.03～0.67，平均值為0.27。34對引物共擴增出191條DNA條帶，得到187條多態性條帶（等位基因）（表6）。基于SSR聚類將56個種質在D-0.64分為3個主要類群（圖1）。第一類群（Ⅰ）共有25個種質資源（No.01、22、02、11、09、15、17、42、16、34、41、14、18、23、39、05、07、13、36、21、44、24、25、47、48），其中84%為中耐、耐旱和高耐。值得注意的是2個高耐品種（No.13和No.16）聚在相近亞群，而3個敏感種質No. 24，No.25和No.47聚在另外相近亞群。第二類群（Ⅱ）由26個種質組成，其中70%為中耐和耐旱。此外，大部分敏感或高敏種質都聚于相近亞群，例如No.03和No.38在一個小亞群中，No.32、29、33、30、53聚在相近亞群。第三類群（Ⅲ）僅包括2份敏感3份中耐種質。以上結果表明，第一組種質可能較耐旱，具有相似的遺傳基礎。第二組種質遺傳基礎復雜，表現出不同程度的耐旱性，第三組種質可能偏敏感。

表 5 56個綠豆品種的綜合指標、指標權重、隸屬函數和綜合評價（D值）Table 5 Comprehensive indices, index weights, subordinate function, and comprehensive evaluation D value on 56 mung bean germplasms

表 6 34對SSR引物在綠豆中的多態性Table 6 Polymorphisms of 34 pairs of SSR primers in mung beans

3 討論與結論

甘露醇模擬干旱的試驗方法被廣泛應用于馬鈴薯[16]、狗尾草[17]、玉米[18]、高粱[19]、油菜[20]等作物中。種子發芽率是衡量種子活力的重要指標之一，但是如果將其作為衡量種子耐旱性的唯一標準，很難全面反映種子萌發期的耐旱性，因此必須建立一套更加綜合全面的種子萌發耐旱評價體系。

本文參考其他作物[12，13，18，21，22]耐旱性鑒定方法，在綠豆中建立了一種基于多項綜合指標評價種子萌發期耐旱性的方法。通過采用這一方法評估56份綠豆種質的萌發耐旱性，鑒定出2份高耐（中綠14和中綠17）和1份高敏種質（中綠3號），其他種質分別鑒定為耐（17.86%）、中耐（53.38%）和敏感（23.21%）。這56份種質中，劉晨旦等[5]對中綠1號（No.01）、中綠2號（No.02）、中綠10號（No.09）、濰綠5號（No.23）、中綠5號（No.05）、中綠8號（No.07）、晉7（No.44）、中綠3號（No.03）、冀綠2號（No.40）、中綠11號（No.10）、晉8（No.45）、保綠942（No.46）、白綠9號（No.50）和白綠10號（No.51）已做過芽期抗旱性鑒定[5]。與之相比，大部分品種的抗性鑒定一致，表現為中耐和耐。但是其中3個品種的抗性鑒定結果存在差異：中綠3號、中綠5號和中綠10號本文分別鑒定為高敏、敏感和中耐，而劉晨旦等[5]分別鑒定為中抗、中抗和高抗。出現這種偏差的原因可能在于本文用到的干旱模擬劑為甘露醇，而劉晨旦等[5]用的是PEG-6000。另外本文以10個耐旱評價相關指標進行綜合評價，而劉晨旦等[5]只選用了其中的4個指標采用隸屬函數值進行評價。盡管如此，大部分品種2種方法鑒定結果一致，表明2種方法都能比較準確的用于鑒定綠豆芽期耐旱性。

在耐旱性鑒定的基礎上，進一步明確其遺傳基礎，將有利于在育種中有針對性的利用這些種質資源。SSR 標記可以產生足夠多的多態性條帶以區分綠豆種質的遺傳多樣性。本研究34對引物中，PIC平均為0.27，最高為0.67（表6），稍低于前人研究結果[11,15]，可能是由于引物數量較少導致。基于SSR的聚類圖將56個種質分為三大類，分別表現出不同的耐旱性（第II類群，圖1）。同時，同一類群中可能在某些位點具有相近的遺傳基礎，但由于其他位點遺傳基礎不同，因而同一類群中的不同種質也有可能表現出不同的耐旱性（第II類群，圖1）。也有可能由于本文用于聚類的SSR引物數量偏少，導致未能將第II類群中種質的遺傳基礎完全分開，因而出現了不同耐旱性的種質聚在同一類群。

圖 1 56份綠豆基于SSR遺傳相似性的聚類圖Fig. 1 Dendrogram of 56 mung bean germplasms clustered by SSR genetic similarity

總之，本文采用綜合指標評價了56份綠豆種質的萌發期耐旱性，鑒定出2份高耐種質，可以為綠豆耐旱育種提供資源。同時，也可為從分子水平解析綠豆萌發耐旱機制奠定基礎。