一例半番鴨感染鴨瘟的病原分離鑒定及病理組織學(xué)觀察

張 瑞，劉榮昌，陳長(zhǎng)福，黃 瑜 ，程龍飛，傅光華，施少華，陳紅梅，萬(wàn)春和，傅秋玲

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建 福州 350002；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013；3. 福建省龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建 龍巖 364000）

0 引言

【研究意義】鴨瘟（Duck plague，DP），又稱鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE），是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種烈性傳染病，其病原為鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）[1]。DPV屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬鴨甲皰疹病毒1型成員，基因組為雙股線狀DNA，大小約160 kb。DPV基因組結(jié)構(gòu)為UL-IRS-US-TRS，主要分為長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（UL）、兩端的內(nèi)部重復(fù)序列（IRS）、短獨(dú)特區(qū)（US）和末端重復(fù)序列（TRS），共包含約78個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）[2]。DPV感染會(huì)引起鴨實(shí)質(zhì)器官局灶性壞死并增加血管通透性，從而導(dǎo)致組織器官、淋巴和消化道大量出血[3]。臨床上，患病鴨主要表現(xiàn)為體溫升高、食欲減退、下痢、眼瞼水腫、流淚等癥狀，發(fā)病率和病死率可高達(dá)100%[4]。目前，鴨瘟仍是危害養(yǎng)鴨業(yè)的嚴(yán)重傳染病之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1923年，Baudet等首次在荷蘭的患病鴨群中發(fā)現(xiàn)鴨瘟病毒，隨后全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了此病的發(fā)生[1]。國(guó)內(nèi)，黃引賢等于1957年在廣州首次報(bào)道了鴨瘟病例[5]。隨著鴨瘟疫苗的研制與應(yīng)用，該病曾得到了有效控制。姜甜甜等[6]報(bào)道了2個(gè)免疫過(guò)鴨瘟病毒疫苗的種鴨群發(fā)病，研究發(fā)現(xiàn)感染該場(chǎng)的鴨瘟病毒主要囊膜蛋白并未發(fā)生變異。2015年，福州的2個(gè)鴨場(chǎng)突發(fā)疫病，病死率高達(dá)93%，劉榮昌等[7]對(duì)此展開(kāi)調(diào)查研究，確定其為DPV感染所致。傅光華等[8]從2016—2017年福建省部分地區(qū)鴨瘟疑似病例中分離到24株鴨瘟病毒，經(jīng)過(guò)序列測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)與我國(guó)DPV參考強(qiáng)毒株相比已出現(xiàn)不同程度的變異。【本研究切入點(diǎn)】2020年8月，福建省福州地區(qū)某半番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫情。該場(chǎng)共飼養(yǎng)半番鴨2 000羽，于200日齡左右開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病1W后其總發(fā)病率約為65%，病死率高達(dá)90%以上。感染后耐過(guò)鴨皮膚表面可見(jiàn)大量出血，嚴(yán)重影響肉鴨的屠宰和上市。該場(chǎng)發(fā)病期間使用多種藥物治療無(wú)效，遂送于本研究室就診?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為明確其病因，分別采集病發(fā)病鴨心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、皮膚等組織進(jìn)行鴨常見(jiàn)病原檢測(cè)、病毒分離鑒定、基因序列測(cè)定分析及病理組織學(xué)觀察，以期為該病的診斷及防控提供科 學(xué)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑

9日齡番鴨胚購(gòu)自莆田溫氏家禽有限公司；EasyPure?Viral DNA/RNA Kit、EasyS-cript?One-Step RT-PCR SuperMix和2×Easy Taq PCR Super Mix購(gòu)自Transgen公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）購(gòu)自Dfico公司；Todd Hewitt Broth購(gòu)自O(shè)XOID公司；高速離心機(jī)為Gene公司產(chǎn)品；PCR儀、電泳儀和凝膠 成像系統(tǒng)Versa Doc 2000為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[9]，合成常見(jiàn)鴨病毒性疾?。ㄇ萘鞲胁《?、新城疫病毒、鴨瘟病毒、禽坦布蘇病毒、鴨甲肝病毒、禽坦布蘇病毒、水禽細(xì)小病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒、鴨星狀病毒、鴨圓環(huán)病毒）檢測(cè)引物。參照文獻(xiàn)[10]，合成UL2基因引物UL2F/UL2R，用于擴(kuò)增鴨瘟病毒的UL2基因。以上引物均由福州鉑尚生物技術(shù)（上海）有 限公司合成。

1.3 病料處理

無(wú)菌采集病死鴨心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊和皮膚等組織，一部分用于鴨常見(jiàn)病毒（RT-）PCR檢測(cè)和病原分離，另一部分用于細(xì)菌分離鑒定。同時(shí)采集發(fā)病鴨心、肝、脾、肺、腎、皮膚等組 織，固定于10%福爾馬林，用于病理組織學(xué)觀察。

1.4 細(xì)菌分離

無(wú)菌采集發(fā)病鴨的腦及肝臟組織，將肝臟和腦組織劃線無(wú)菌接種于不同培養(yǎng)基平板（麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板）上，37 ℃恒溫 培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.5 （RT）PCR檢測(cè)

按北京全式金生物技術(shù)有限公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒操作，提取病毒核酸。參照文獻(xiàn) [9]，進(jìn)行鴨常見(jiàn)病毒（RT-）PCR檢測(cè)。

1.6 病毒分離與鑒定

將采集的內(nèi)臟和皮膚組織分別剪碎、勻漿，加入PBS制成1∶5組織懸液，反復(fù)凍融3次，6 000 r·min?1離心10 min，加雙抗作用30 min后，用220 nm濾器過(guò)濾。濾液各以200 μL·枚?1經(jīng)尿囊腔接種9日齡番鴨胚5枚37 ℃恒溫孵化，連續(xù)觀察7 d，無(wú)菌收集死亡胚尿囊液，盲傳3代，收集尿囊液，對(duì)收集的尿囊液進(jìn)行鴨常見(jiàn)病毒（RT-）PCR檢測(cè)。樣品于?80 ℃儲(chǔ) 存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 序列測(cè)定與分析

使用引物UL2F/UL2R擴(kuò)增新分離鴨瘟病毒的UL2基因，按照EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明，提取樣品中病毒核酸。獲得的DNA樣品用Easy Script One-Step PCR SuperMix試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)按50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增：2×Easy Taq PCR Super Mix 25 μL，ddH2O 17.5 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA模板5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物送福州 鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 組織病理學(xué)觀察

對(duì)上述（1.3）固定的組織依次按照修塊、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（4 μm）的步驟制備病理切片，經(jīng)HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察病理組 織學(xué)變化，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病變

送檢病鴨可見(jiàn)頭頸腫脹（圖1-A），皮膚表面有大量散在的點(diǎn)狀或塊狀出血（圖1-B），肝臟腫脹，外觀呈不均勻斑駁狀，表面有不規(guī)則的出血點(diǎn)或出血斑（圖1-C）。

圖 1 發(fā)病鴨鴨剖檢病變圖Fig. 1 Necropsy lesions in diseased ducks.

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.2.1 細(xì)菌分離結(jié)果 無(wú)菌挑取病死鴨腦及肝臟組織接種于不同培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，所接種 平板均未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，因此可排除細(xì)菌感染。

2.2.2 （RT）PCR檢測(cè) ? 對(duì)臨床樣品進(jìn)行鴨瘟、禽流感、新城疫、鴨肝炎、禽坦布蘇病毒、水禽細(xì)小病毒、鴨3型腺病毒、禽4型腺病毒、呼腸孤病毒、鴨星狀病毒和鴨圓環(huán)病毒等鴨常見(jiàn)病原檢測(cè)，結(jié)果在實(shí)質(zhì)臟器及皮膚組織中均檢測(cè)出鴨瘟病毒，其余病原檢測(cè)均為陰性（圖2）；由此，可初步判斷該 病例為DPV感染所致。

2.3 病毒分離與鑒定

將病鴨內(nèi)臟和皮膚組織勻漿液分別接種9日齡番鴨胚，48～144 h可陸續(xù)觀察到胚體死亡，死亡胚體出現(xiàn)水腫和出血。收集接種后死亡鴨胚尿囊液，對(duì)收集尿囊液和胚體按1.5方法進(jìn)行（RT-）PCR檢測(cè)，結(jié)果均為DPV陽(yáng)性（圖3），表明新分離病毒為 鴨瘟病毒，將該株病毒命名為FJ2020176。

2.4 UL2基因序列測(cè)定與分析

以新分離鴨瘟病毒核酸為模板，進(jìn)行UL2基因擴(kuò)增，結(jié)果獲得包含UL2全基因的1 311 bp片段，與預(yù)期相符（圖4）。

對(duì)新分離鴨瘟病毒UL2基因序列進(jìn)行測(cè)定，去除前后多余的核苷酸序列，獲得全長(zhǎng)為1 002 bp的UL2基因完整序列，將測(cè)得序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GenBank登錄號(hào)為MW032438。序列比對(duì)分析顯示，新分離株FJ2020176 UL2基因與DPV強(qiáng)毒株CHv株、CV株和2085株核苷酸相似性高達(dá)97.8%～99.9%（圖5）。與疫苗株VAC株、Attenuated strain 1株和Attenuated strain 2株相比，新分離鴨瘟病毒FJ2020176株在UL2基因中存在528 bp的核苷酸 插入，表明FJ2020176株為鴨瘟病毒強(qiáng)毒株。

圖 2 臨床采集樣品的PCR檢測(cè)Fig. 2 PCR detection on clinical samples

圖 3 臨床采集樣品的PCR檢測(cè)Fig. 3 PCR detection on clinical samples

圖 4 分離病毒的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 PCR amplification result on isolated virus

2.5 組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)肝臟發(fā)生局灶性壞死，肝臟出血、肝細(xì)胞壞死（圖6-A、B）；脾臟組織白髓減少，淋巴細(xì)胞壞死、脫落（圖6-C、D）；腎臟出血、淤血，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死（圖6-E、F）；法氏囊出血，淋巴小結(jié)壞死（圖6-G、H）；皮下出血（圖6-I、J）。

圖 5 鴨瘟病毒UL2基因同源性分析Fig. 5 Homology on UL 2 gene of duck plague virus

圖 6 感染鴨組織病理切片F(xiàn)ig. 6 Pathological slices of infected duck tissues

3 討論與結(jié)論

我國(guó)的鴨瘟病毒抗原性高度保守，相關(guān)疫苗的使用對(duì)該病可起到顯著的預(yù)防效果[1]。但近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)鴨場(chǎng)中常出現(xiàn)已免疫鴨群發(fā)病的情況[6,11]，加之缺少典型病變鴨瘟病例的出現(xiàn)[7]，使得鴨瘟的診斷和防控形勢(shì)變得愈加復(fù)雜。因此，在臨床上，除了觀察患病鴨的特征性病變外，還應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，以免出現(xiàn)誤診。

DPV侵染機(jī)體可引起實(shí)質(zhì)器官漸進(jìn)性的退行性變化，以及由于血管損傷而引起的組織出血和體腔溢血[12]，本病例臨床剖檢可見(jiàn)肝臟的輕微腫大、出血。較為特別的是，臨床癥狀除了頭頸腫脹這一鴨瘟典型癥狀外，還表現(xiàn)為皮膚的大面積出血，此癥狀在以往的報(bào)道中未曾出現(xiàn)。同時(shí)，從皮膚中成功分離出鴨瘟病毒，表明此株鴨瘟病毒入侵的靶器官可能還包括皮膚組織，病毒的組織嗜性是否有所改變，還需進(jìn)一步研究。對(duì)FJ2020176株的UL2基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其與強(qiáng)毒株CHv株、CV株和2085株有極高的同源性；與弱毒株相比，在UL2基因中間有528 bp的插入，符合鴨瘟強(qiáng)毒株特征[13]，表明新分離的DPV為鴨瘟病毒強(qiáng)毒株。

組織病理學(xué)觀察顯示，DPV對(duì)感染鴨內(nèi)部組織器官有不同程度的損傷，其中以肝臟、脾臟、腎臟等實(shí)質(zhì)臟器出血、淤血最為明顯。脾臟和法氏囊是禽類重要的免疫器官，這些免疫器官在識(shí)別和清除體內(nèi)的抗原性異物和自身變性細(xì)胞中具有重要作用[14]。本病例的脾臟和法氏囊也有一定程度的病變，病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)感染鴨脾臟紅髓和白髓結(jié)構(gòu)不清，白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞減少；法氏囊淋巴細(xì)胞出現(xiàn)缺失和壞死，預(yù)示著患鴨免疫功能可能下降，機(jī)體易受到其他病原體的侵害。肝臟和腎臟也有相似的病變，表現(xiàn)為肝、腎的出血、瘀血和相關(guān)組織細(xì)胞的壞死，由此可見(jiàn)，患鴨的免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)均已遭到病毒損壞。外部組織的病變則以皮下大面積出血為特征，組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)皮下有大量出血、淤血，與臨床剖檢結(jié)果一致。此次送診的病例，除皮膚的病理變化外，其余各臟器病理變化均與已報(bào)道的鴨瘟病變基本相符[15,16]。

未免疫鴨瘟疫苗是該場(chǎng)鴨群發(fā)病的主要原因，因此在生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)提高免疫意識(shí)，制定合理的免疫程序，選擇合適疫苗及時(shí)免疫，切不可掉以輕心，以免造成損失。本研究對(duì)一起皮膚大量出血的發(fā)病鴨群進(jìn)行病原分離鑒定及病理組織學(xué)觀察，并從該發(fā)病鴨皮膚組織中分離到一株鴨瘟病毒強(qiáng)毒株，表明皮膚出血亦為鴨瘟病例的臨床特征。以上結(jié)果為臨床上鴨瘟的診斷提供了新的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。