兩株非典型煙曲霉臨床株抗真菌藥物敏感性和形態異常相關分子機制研究

姜 媛 張彩云 孔慶濤 桑 紅

1南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院)皮膚科,江蘇南京,210006；2南京市中醫院，江蘇南京，210001；3東部戰區總醫院皮膚科，江蘇南京，210002

侵襲性真菌感染在近幾年的發病率不斷升高，每年感染死亡人數超過一百萬[1]。其中侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的發病率在侵襲性真菌感染中的比例越來越高，侵襲性曲霉病患者臨床癥狀比較嚴重，致死率可高達50%～95%[2],因此，早期正確的診斷對于侵襲性曲霉病高風險患者十分重要。

煙曲霉是導致侵襲性曲霉病最主要的病原體[3],在形態上與煙曲霉相似的新真菌逐漸被報道，進而導致煙曲霉被誤診率也逐漸增多。目前，煙曲霉形態學研究已較為成熟,在營養豐富的培養基上，煙曲霉一般會表現為灰綠色、粉末狀、放射性生長絲狀型菌落，在光學顯微鏡下觀察有分生孢子形成。煙曲霉的傳播主要是通過無性孢子感染宿主來實現；煙曲霉孢子既是它自身存在和傳播的方式，也是感染人類的根源，大量的孢子很容易擴散到環境中，易感人群可以通過吸入孢子而感染該病菌[4]。但最新研究發現，存在形態學、毒力等方面均不具有上述特點的煙曲霉[5，6]；Zhang等[6]已經報道過第一例非典型的(白色不產孢)煙曲霉(命名為A1j)，且經過長時間的傳代，形態仍然未變。我們團隊先前已經報道兩株非典型煙曲霉在形態學和毒力方面的差異，發現兩株非典型煙曲霉生長速度不同，A2j的生長速度快，且耐熱性高，毒力強[5]。

目前，用于治療侵襲性肺曲霉病的抗真菌藥物包括以下三種：以伊曲康唑和伏立康唑為代表的唑類抗真菌藥、以兩性霉素B為代表的多烯類抗真菌藥、以卡泊芬凈為代表的棘白素類。其中伏立康唑是目前治療曲霉病的一線藥物，AMB最常用多烯類藥物[4，7，8]。另外，抗真菌藥的廣泛使用，使耐藥性曲霉菌增多，新一代抗真菌藥物的開發刻不容緩[8]。

在此背景下，我們將兩株非典型煙曲霉(A1j和A2j)臨床株與參照株Af293進行對比，研究其對抗真菌藥物敏感性及形態學異常相關產孢分子機制。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養基 A2j：從患者的肺組織標本中分離純化的曲霉屬真菌，現保存于中國醫學真菌菌種保藏中心(CMCC，中國醫學科學院皮膚病研究所)。菌株采用酵母瓊脂葡萄糖(YAG)培養基[6]。

1.2 分子鑒定 A2j采用如下方法進行鑒定：將菌株放在沙氏培養基(SDA)(10 g蛋白胨+12～15 g瓊脂+40 g葡萄糖+1L蒸餾水)上25℃恒溫培養7 d[9]，接著提取A2j DNA基因，采用真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)，然后進行測序比對。選用真菌通用引物如下：ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴增ITS區域(包括ITS-1, ITS-2,和5.8S rRNA)[6]，benA-F(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和benA-R(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)擴增β-tub部分基因序列[9，10]。

1.3 形態學特征 (1)培養條件：在 YAG培養基37℃的恒溫培養箱中培養1 d、3 d、4 d、6 d，觀察A2j菌落形態；(2)小培養法：本研究中采用的小培養法參照已有文獻報道并稍作改動的改良小培養法[6]，具體操作步驟是：首先準備好數個YAG平板(根據觀察菌種的數量來定)，取出一個平板，用無菌的手術刀將其中的培養基劃成邊長7～10 mm的小塊；然后在新YAG平板上放置5～6個劃好的小塊(各小塊之間留出適當的空間)；再在小塊各邊中點上用接種針(或滅菌的牙簽)接種相應的菌株；然后將18 mm×18 mm的蓋玻片蓋上，蓋好培養皿蓋后放入37℃的恒溫培養箱中進行培養18 h，然后用棉蘭染色放在DIC顯微鏡下觀察各菌落形態。最好每個平板中只接種一種菌，防止培養時間長時出現相互播散的狀況。

1.4 試劑 ①裂解液:400 mM Tris-HCl(PH8.0),60 mM EDTA(PH8.0),150 mM NaCl，1% SDS；②KAC(PH 4.8,100 mL): 5M乙酸鉀60 mL,冰醋酸11.5 mL, 蒸餾水28.5 mL；③焦碳酸二乙酯(DEPC)： 500 mL去離子水中先加入500 μL DEPC，然后搖床過夜，第二天高溫高壓滅菌30 min。

1.5 抗真菌藥物敏感性試驗

1.5.1 將伏立康唑(VRC),兩性霉素B(AMB)和伊曲康唑(ITC)用二甲基亞砜(DMSO，上海生工)溶解成適當濃度的母液備用。

1.5.2 藥物平板的配制 首先配置好適量的YAG培養基，接著進行高壓滅菌冷卻至60℃左右，每次倒出9 mL在離心管中，加入并混勻適當體積的藥物母液后立即倒入無菌平板中，制成不同濃度的各種藥物平板。然后在超凈臺中吹干冷凝備用。這些藥物平板最好能夠現配現用，以防藥物失效。

1.5.3 Af293菌懸液的配制 將Af293接種于YAG固體平板，37℃恒溫培養2 d。用0.002% Tween 80收集孢子，經8層紗布過濾后用血細胞計數板計數，并稀釋成108/mL的孢子懸液,最好當天配當天用。

1.5.4 接種步驟 為保證菌絲塊面積的一致，對菌落采用打孔的方法[6]：首先將A1j和A2j分別接種到YAG固體平板上，37℃恒溫培養2 d；將100 μL濃度為108/mL的對照菌Af293新鮮孢子液到YAG平板上，并在37℃培養15 h；從而確保三株菌都為菌絲狀態。然后用5 mm的打孔器將上述菌絲分別放入濃度分別為：2, 4, 8, 16, 32 μg/mL ITC平板中; 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μg/mL VRC平板中; 4, 8, 16, 32, 64 μg/mL AMB平板中;并在37℃恒溫培養1.5 d。

1.5.5 統計學方法 三株菌37℃恒溫培養1.5 d后從平板背面測量菌落直徑(D)。為了減少誤差，將各個藥物平板菌落直徑減去原始接種直徑(5 mm)后與不加藥物的菌落直徑減去原始接種直徑(5 mm)后的差值作比值，即(Dstrain+drug-5 mm)/(Dstrain-5 mm)，來比較各種藥物對三株菌的相對抑制程度。實驗將重復3次，并以中位數±四分位數間距描點作圖。

1.6 DNA，RNA提取和分析

1.6.1 RNA提取和qRT-PCR分析的樣品準備 將制備好的A1j和A2j菌絲片和100 μL濃度為108/mL Af293的孢子懸液，分別接種到100 mL YAG液體培養基中；并置于220 rpm 轉速的37℃的溫控搖床中培養18 h。然后用4層無菌紗布濾出菌絲球，重新在37℃恒溫培養6 h[6]；完成后用錫箔紙將干菌絲球，液氮速凍30 min，存放于-80℃的超低溫冰箱中，完成產孢誘導前的樣品。

1.6.2 1%瓊脂糖凝膠的制備 以1 g瓊脂：100 mL TAE (1×)的比例混合，放入微波爐中加熱至沸騰2～3次，直至膠液澄清透明。稍冷卻后滴入少量EB至液體顏色微微改變，混勻后倒入膠槽中，約20 min凝固后即可使用。短期可保存于蒸餾水中。

1.6.3 RNA提取方法(Trizol法)和 qRT-PCR的提取 用Trizol法提取總RNA，然后根據RevertAidTM First strand eDNA Synthese Kit試劑盒說明逆轉錄得到 cDNA,以逆轉錄的eDNA為模板，用Taqman探針法進行PCR產物的實時熒光定量分析。

2 結果

2.1 A2j的鑒定 通過對A2j的ITS區(包含ITS-1，ITS-2和5.8S rRNA基因)和部分β-微管蛋白基因(β-Tub)進行測序來進行分子鑒定。結果顯示，在NCBI中，該分離株序列與煙曲霉ITS具有99%的相似性，與煙曲霉β-Tub序列具有100%的相似性。 在AspGD(http://www.aspgd.org/)中，分別為99.5%和99.8%。因此，其被準確鑒定為煙曲霉。

2.2 形態學特征

2.2.1 不同時間的菌落形態 如圖1所示，A2j一直保持增長趨勢，且一直表現為白色毛毯狀菌落，生長速度基本與Af293相當。

圖1 A2j不同培養時間的菌落形態

2.2.2 小培養和DIC顯微鏡下觀察 兩株菌株采用小培養的方法置于37℃的恒溫培養箱中培養18 h，接著在DIC顯微鏡下觀察兩者的產孢情況。如圖2所示，A2j可見分支分隔的菌絲，但是始終未見產孢，Af293可見典型的產孢結構。

圖2 A2j(2a)DIC顯微鏡下的形態與野生型Af293(2b)的對比 圖3 在不加藥時A1j和A2j生長速度與野生型Af293的對比

2.3 抗真菌藥藥敏試驗 在不加藥時A1j的生長速度比Af293慢(圖3)。對于ITC,A1j和Af293生長趨勢一致，但是在低藥濃度時A1j表現比Af293更敏感，當濃度達到8 μg/mL時，兩者無統計學差異(圖4，P=0.076)。對于AMB,兩株菌生長趨勢同樣一致,但是在高藥濃度時A1j似乎比Af293更敏感(圖5)。對于VRC,A1j與Af293表現出一致趨勢，但是在濃度為0.125 μg/mL時已無統計學差異(圖6,P=0.083)。在不加藥物時，A2j生長速度與Af293差不多(圖3)。ITC,AMB和VRC普遍表現為在抑制Af293時也抑制A2j。對于ITC, 當藥物濃度在8 μg/mL之前均表現為A2j受抑制程度比Af293高，藥物濃度達到16 μg/mL時，Af293受抑制程度比A2j高(圖7)。對于AMB,當藥物濃度大于16 μg/mL時，它們表現出相同抑制程度，小于16 μg/mL時，A2j受抑制程度比Af293高(圖8)。但是對于VRC,兩株菌表現出明顯一致的差異，當濃度達到2 μg/mL時已無統計學差異(圖9，P=1.000)。因此，無論是A2j與Af293，還是A1j與Af293，在藥物敏感性方面均沒有顯著差異。

圖4 A1j對ITC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖5 A1j對AMB抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖6 A1j對VRC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖7 A2j對ITC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖8 A2j對AMB抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

圖9 A2j對VRC抗真菌藥物的敏感性與野生型Af293的對比

2.4 形態異常產孢相關分子機制

2.4.1 產孢下游基因brlA和wetA qRT-PCR表達差異的結果 如圖10所示，經固體培養6 h后，Af293的wetA沒有明顯變化，但brlA轉錄水平卻顯著上升。且brlA FC(6 h/0 h)值達到了21.82±0.88，而A1j和A2j中對應的3個基因則無明顯變化。

圖10 調控產孢的兩個基因，brlA和wetA在產孢誘導條件下在A1j、A2j和Af293中的表達分別受誘導程度的qRT-PCR分析結果

2.4.2 brlA基因測序 由于brlA是調控A. fumigatus分生孢子梗形成的最關鍵基因，因此我們PCR擴增A1j的brlA基因全長進行測序，并在曲霉專業數據庫AspGD和NCBI上分別進行比對，結果顯示比對率為99.9%和100%，同時進行峰圖比對沒有發現突變點，說明A1j的brlA基因無突變。A2j的brlA基因全長進行測序，并在曲霉專業數據庫AspGD和NCBI上分別進行比對，結果顯示比對率為99.8%和99%，同時進行峰圖比對發現存在TCCT缺失。

3 討論

煙曲霉是一種引起免疫缺陷群體患有侵襲性曲霉病的主要致病菌，該病致死率極高[2]。為避免與煙曲霉形態學相似的物種所導致的曲霉病誤診情況的發生，推薦使用分子鑒定方法。常用的兩種分子鑒定方法是：對真菌基因組DNA保守序列ITS和b-tub進行測序比對。前者能將真菌鑒定到種的水平，后者可以鑒定到屬的水平[11]；此次試驗結合上述兩種方法，來實現新發現的煙曲霉復合體的準確鑒定。

本研究中所用到的三種抗真菌藥物，AMB、ITC和VRC，作為經典的抗真菌藥物作用機制如下：唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑)的作用機制是抑制麥角固醇合成途徑中的重要酶-羊毛固醇-14a-脫甲基酶(cyp51A)的合成。而兩性霉素B(AMB)是通過影響細胞的正常代謝從而抑制其生長來發揮作用，它損傷細胞膜的通透性從而使細胞內重要物質外漏、破壞[11,12]。兩株非典型煙曲霉在對抗真菌藥物敏感性方面沒有差異，這表明它們在麥角固醇合成途徑方面均沒有明顯缺陷。

近年來，有學者闡明了調節煙曲霉分生孢子形成的通路[13],該通路包括三個關鍵基因即brlA,abaA和wetA。其中brlA是啟動曲霉孢子產生的關鍵基因[13,14]，表達于孢子形成的早期階段。brlA突變株產生較細菌絲，且不能產生無性產孢結構，這表明brlA在初始階段煙曲霉孢子形成過程中很重要。不僅如此，brlA也會影響孢子形成相關其他基因的表達，比如：abaA, wetA, vosA,和rodA。brlA參與其他生物功能：brlA刪除株將改變與孢子色素形成、膠霉毒素的生物合成和核糖體的途徑相關的基因；brlA刪除株會使GliM和GliT蛋白表達減少和膠霉毒素不能產生。另外，abaA是調節瓶梗分化和功能的關鍵基因，它的表達主要依賴brlA，而非wetA。wetA對孢子的完整性很重要，wet缺乏株導致孢子缺乏細胞壁及黑色素，wet刪除株也會降低菌絲的延伸能力[15]。

本文采用RT-PCR方法研究兩株白色煙曲霉產孢相關主要基因brlA和wetA發現：調控下游通路的關鍵基因brlA表現A1j和A2j均下降；從而解釋了為什么A1j和A2j能夠表現出穩定的可傳代的白色絨毛狀且不產孢的形態。brlA基因的全長測序顯示A1j無突變, 但實驗結果顯示A2j存在基因突變(TCCT堿基缺失)。A2j的brlA基因TCCT堿基缺失是首次報道。對這兩株白色煙曲霉研究將提高我們對這種白色不產孢煙曲霉的認識，有利于其他研究者對這種非典型煙曲霉的研究，同時brlA基因抑制劑有望成為下一代曲霉病治療新方法。

綜上所述，本次研究成果可歸納為以下幾點：(1)藥物敏感性方面，A1j和A2j的抗真菌藥物藥敏性方面無差異，這表明它們在麥角固醇合成途徑方面沒有明顯缺陷。(2)形態異常相關產孢基因方面 ，A1j和A2j的brlA基因均下降，brlA基因的全長測序顯示A1j無突變, A2j存在TCCT堿基缺失。這是否與兩株菌毒力差異有關，以及形態相關產黑相關基因是否也有差異，這都將有待進一步研究。