Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)-GHRP-6減輕肥胖小鼠的脂肪炎癥和氧化應激

孟棟棟，魏凱迪，侯靜文，吳麗娜，馬曉君

肥胖癥是一種以營養過剩導致的過度脂肪沉積為特征的慢性代謝炎癥性疾病，其能引起胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、非酒精性肝病、心血管疾病和2型糖尿病等多種并發癥。饑餓激素(Ghrelin)是一種能促進生長、食欲和調節能量的生長激素釋放肽，也是肥胖的關鍵調節因子之一。雖然，肥胖癥的發病因素眾多，但過度膳食高脂肪食物是大部分肥胖癥的直接原因。因此，該研究采用高脂飲食(high fat diet，HFD)誘導的肥胖小鼠模型，觀察Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys)-生長激素釋放肽6[(D-Lys)-growth hormone-releasing peptide 6，(D-Lys)-GHRP-6]對肥胖的影響，并分析其中涉及的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實驗動物 24只SPF級3～4周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質量(12±0.5)g，購自武漢大學動物實驗中心，飼養于鄭州大學動物實驗中心的SPF級動物房，小鼠適應飼養1周后，進行后續實驗。

1.1.2

主要試劑與儀器 (D-Lys)-GHRP-6試劑(純度>98%，南京萊昂生物科技有限公司)；小鼠單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) ELISA試劑盒(#RK00381)、白細胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA試劑盒(#RK00008)、腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)-α ELISA試劑盒(#RK00027)和IL-10 ELISA試劑盒(#RK00016)(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；抗F4/80抗體(ab6640)和抗perilipin抗體(ab61682)(美國Abcam公司)；抗CD11c抗體(#MCA1369)和抗CD206抗體(#MCA2235)(美國AbD Serotec公司)；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(#A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性測定試劑盒(#A003-1-2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定試劑盒(#A007-1-1)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)活性測定試劑盒(#A002-1-1)(南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性試劑盒(#CGP1)(美國Sigma公司)；黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)活性試劑盒(#Hz031012)(上海滬震生物科技有限公司)。Echo MRI-100型全身成分分析儀(美國Echo Medical Systems公司)；DP72顯微鏡數碼成像系統和FV500型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；BD LSRFortessa型流式細胞分析儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1

小鼠分組與處理 24只小鼠隨機分為常規飲食(regular diet，RD)、高脂飲食(HFD)和HFD+(D-Lys)-GHRP-6組，每組8只。RD組小鼠采用普通小鼠顆粒飼料(含16%脂肪、60%碳水化合物和24%蛋白質)飼養16周；HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠采用高脂飼料(含42%脂肪、42.7%碳水化合物和15.3%蛋白質)飼養16周，且從第9周起，每天通過腹腔注射50 mg/kg (D-Lys)-GHRP-6；HFD組小鼠采用高脂飼料飼養16周，從第9周起，每天通過腹腔注射與HFD+(D-Lys)-GHRP-6組等體積的生理鹽水。所有小鼠在飼養期間，每周稱量1次體質量。小鼠禁食8 h，用電子分析天平稱重，每只小鼠分別稱2次，記錄平均值。在第16周飼養方案結束時，進行后續研究。

1.2.2

小鼠體脂分析 用50 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠，在麻醉狀態下，用Echo MRI-100全身成分分析儀評估小鼠的體脂率和脂肪成分。

1.2.3

組織和血清樣本的收集 用50 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠后，摘取眼球取血，并分離血清。處死小鼠，在仔細解剖后取附睪白色脂肪組織(epididymal WAT，eWAT)、皮下白色脂肪組織(subcutaneous WAT，sWAT)和肩胛間棕色脂肪組織(interscapular BAT，iBAT)樣品。

1.2.4

ELISA檢測 取各組小鼠的血清樣品，按照說明書步驟，用ELISA法檢測MCP-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

1.2.5

氧化應激水平檢測 取各組小鼠的血清樣品，按照說明書步驟檢測SOD、CAT、GPx、MDA、XO以及XDH的活性。

1.2.6

HE染色 按照常規法用石蠟包埋eWAT、sWAT和iBAT脂肪組織，并切為5 μm厚度的切片。石蠟切片經脫蠟和水化后進行HE染色。用DP72顯微鏡數碼成像系統獲取HE染色圖像。每只小鼠任選5個切片，每個切片任選3個視野圖像，用Image J 1.47i軟件測量eWAT和sWAT組織的脂肪細胞直徑和評估iBAT組織的脂滴水平。

1.2.7

免疫熒光染色 取各組eWAT組織石蠟切片(5 μm厚)，經脫蠟和水化后，室溫避光孵育F4/80和perilipin抗體(均1 ∶1 000稀釋)2 h，PBS洗滌后，室溫分別孵育Alexa Flor 488和Alexa 647標記的二抗(均1 ∶200稀釋)1 h，PBS再次洗滌后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并獲取圖像。F4/80用于評估脂肪組織的冠狀結構(crown-like structure，CLS)，perilipin用于顯示脂肪細胞。每只小鼠任選5個切片，每個切片任選3個視野圖像，用Image J 1.47i軟件統計CLS結構數。

1.2.8

流式細胞術分析 按照文獻描述的方法分別從各組eWAT組織中分離出血管基質組分(stromal vascular fraction，SVF)。用PBS洗滌細胞后，分別室溫避光孵育F4/80-PE、CD206-Alexa Fluor 647和CD11c-FITC抗體(均1 ∶500稀釋)30 min。染色后用2%(W/V)多聚甲醛固定細胞10 min，然后用流式細胞儀分析巨噬細胞(F4/80+細胞)中M1表型(CD11cCD206細胞)和M2表型(CD206CD11c細胞)的比例。

1.3 統計學處理

采用SPSS 24.0軟件進行分析，實驗數據均以表示，小鼠體質量動態變化采用重復測量的雙因素方差分析，其余數據比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用LSD法。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠平均體質量、體脂率及脂肪成分的比較

從第4周起，HFD組小鼠平均體質量高于RD組；從第11周起，HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠平均體質量低于HFD組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)，見圖1A。在第16周，HFD組小鼠體脂率高于RD組，而HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠體脂率低于HFD組，差異均有統計學意義(

F

=24.356，

P

<0.05)，見圖1B。對脂肪成分進行分析，HFD組小鼠eWAT、sWAT和iBAT高于RD組小鼠eWAT、sWAT和iBAT，而HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠eWAT、sWAT和iBAT低于HFD組，差異均有統計學意義(

F

=17.168、

F

=28.794、

F

=6.431，

P

<0.05)，見圖1C。對脂肪組織進行HE染色，結果顯示，HFD組小鼠eWAT的脂肪細胞直徑、sWAT的脂肪細胞直徑和iBAT的脂滴水平均高于RD組，而HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠eWAT的脂肪細胞直徑、sWAT的脂肪細胞直和iBAT的脂滴水平均低于HFD組，差異均有統計學意義(

F

=23.245、

F

=36.543、

F

=68.721，

P

<0.05)，見圖1D～F。

2.2 各組小鼠血清炎癥因子及脂肪組織巨噬細胞數目與極化的比較

ELISA結果顯示，與RD組比較，HFD組小鼠血清中促炎因子(IL-6和TNF-α)和巨噬細胞募集因子MCP-1的水平增加，抑炎因子IL-10的水平降低；與HFD組比較，HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1的水平降低，IL-10的水平有所回升；差異均有統計學意義(

F

=28.426、

F

=45.628、

F

=15.214、

F

=17.379，

P

<0.05)，見圖2。免疫熒光結果顯示，HFD組小鼠eWAT組織中CLS數高于RD組；而HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠eWAT組織中CLS數低于HFD組，差異均有統計學意義(

F

=56.625，

P

<0.05)，見圖3A。流式細胞術結果顯示，與RD組比較，HFD組小鼠eWAT組織的SVF中巨噬細胞總數和巨噬細胞中M1表型比例均增加，M2表型比例降低；與HFD組比較，HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠eWAT組織的SVF中巨噬細胞總數和巨噬細胞中M1表型比例均降低，M2表型比例增加；差異均有統計學意義(

F

=38.765、

F

=30.524、

F

=45.642，

P

<0.05)，見圖3B。

圖1 (D-Lys3)-GHRP-6治療可改善HFD誘導的小鼠肥胖癥

圖2 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10和MCP-1的水平 1：RD組；2：HFD組；3：HFD+(D-Lys3)-GHRP-6組；與RD組比較：*P<0.05；與HFD組比較：#P<0.05

圖3 (D-Lys3)-GHRP-6治療對HFD誘導的巨噬細胞極化的影響

2.3 各組小鼠血清氧化應激水平的比較

為評估(D-Lys)-GHRP-6對HFD誘導的肥胖小鼠血清中氧化應激水平的影響，本研究檢測了SOD、CAT、GPx、MDA、XO和XDH活性。結果顯示，與RD組比較，HFD組小鼠血清中抗氧化劑SOD、CAT和GPx活性降低，氧化劑MDA、XO和XDH活性升高；與HFD組比較，HFD+(D-Lys)-GHRP-6組小鼠血清中SOD、CAT和GPx活性升高，MDA、XO和XDH活性降低；差異均有統計學意義(

F

=12.162、

F

=15.384、

F

=8.179、

F

=22.361、

F

=35.716、

F

=24.653，

P

<0.05)，見圖4、5。

3 討論

近年來研究表明，Ghrelin能促進食欲、加劇IR和促進肥胖。Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys)-GHRP-6則被發現具有抑制食欲、增加胰島素敏感性和加快能量消耗的作用，提示其可能具有抵抗肥胖的潛力。本研究通過HFD構建肥胖小鼠模型，觀察(D-Lys)-GHRP-6對HFD誘導的肥胖的影響，結果顯示，(D-Lys)-GHRP-6能抵抗HFD誘導的脂肪蓄積和增重，提示其是潛在的減肥劑。

圖4 各組小鼠血清中抗氧化劑SOD、CAT和GPx的活性 1：RD組；2：HFD組；3：HFD+(D-Lys3)-GHRP-6組；與RD組比較：*P<0.05；與HFD組比較：#P<0.05

圖5 各組小鼠血清中氧化劑MDA、XO和XDH的活性 1：RD組；2：HFD組；3：HFD+(D-Lys3)-GHRP-6組；與RD組比較：*P<0.05；與HFD組比較：#P<0.05

由脂肪過度蓄積導致的脂肪細胞肥大和增生是肥胖癥中慢性脂肪炎癥的必經過程，其能增加促炎因子和急性期蛋白的分泌，并減少抑炎性因子的分泌。本研究結果顯示，(D-Lys)-GHRP-6能降低肥胖小鼠eWAT和sWAT組織的脂肪細胞直徑和脂肪炎癥。脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages，ATMs)是介導脂肪炎癥的主要效應細胞，其在協調代謝炎癥中起著關鍵作用。在肥胖狀態下，ATMs主要圍繞在病變和/或死亡的脂肪細胞周圍形成的CLS結構上，表現為促炎M1表型，能促進促炎因子分泌；而在精瘦狀態下，ATMs呈分散均勻分布，主要表現為抗炎M2表型，其能提高BAT活性和促進WAT褐變，從而調節機體適應性產熱和能量消耗。促進ATMs由M1表型向M2表型轉換能改善HFD導致的脂肪炎癥和肥胖癥。本研究結果也顯示，(D-Lys)-GHRP-6不僅能抑制HFD導致的促炎性巨噬細胞向脂肪組織的募集，還能加速其由M1表型向M2表型轉換，進而減輕肥胖導致的脂肪炎癥。

氧化應激在維持脂肪的儲存能量和代謝穩態的功能中起著重要作用。肥胖代謝產物能加劇機體內氧化應激反應，且氧化應激異常又能進一步導致IR、脂肪炎癥、血脂代謝異常和肥胖；而維持氧化應激平衡能改善肥胖導致的IR、血脂代謝異常和脂肪炎癥。本研究顯示，(D-Lys)-GHRP-6能修復HFD導致的氧化應激失衡。

綜上所述，(D-Lys)-GHRP-6可能通過抑制促炎性巨噬細胞募集并加速其M1表型向M2表型轉換和維持氧化應激平衡來緩解HFD誘導的肥胖和脂肪炎癥。