不同C/N生物絮團對洛氏鱥急性銅暴露保護作用

于 哲 吳莉芳 李 良 朱 瑞

(1. 吉林農業大學生命科學技術學院, 長春 130118; 2. 吉林農業大學動物科學技術學院,動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室, 長春 130118)

隨著工業的快速發展, 各種重金屬及其類似物廢水直接或間接地排入江河湖海之中, 對水環境造成了不可恢復的污染[1—3]。銅是水體中主要的重金屬污染物之一, 也是維持生命正常發育和新陳代謝所必需的重要微量元素。以魚類為主的水生生物對銅有一定的富集和積累能力, 然而過量的積累將擾亂水生動物的正常生命活動, 造成其急、慢性中毒甚至死亡[4,5]。生物絮團技術(BFT)是近年來發展起來的一種環境友好型養殖模式, 它的基本原理主要是循環利用剩余的營養物質, 以產生微生物生物量, 這些微生物生物量既可以用來就地喂養養殖的魚類, 也可以作為動物飼料的一種成分進行收獲和加工[6—8]。同時, BFT不僅可以作為微生物的載體, 還能通過調節養殖池中微生物的組成, 利用微生物之間的相互作用, 轉化對系統中生物有很高毒性的氨氮和亞硝酸鹽, 來實現控制水質的目的[9,10]。目前, 關于重金屬銅對水體污染的研究較少, 主要體現在介紹銅對水生生物的危害上, 如: 組織積累、氧化應激、炎癥反應及免疫抑制等[11—13]; 關于生物絮團的研究, 主要集中在: BFT對水生生物(魚、蝦等)營養與免疫的研究[7,9]、對養殖水體水質的研究[8]、對腸道菌群的研究[14]及關于生物絮團C/N的研究[15—17]。而關于不同C/N生物絮團對急性銅暴露洛氏鱥的免疫、抗氧化酶活性及炎癥反應的影響則鮮有研究。

本實驗甄選病害少, 抗逆性強, 味道鮮美, 無肌間刺, 營養價值高, 深受廣大養殖人員與消費者喜愛的我國土著雜食性小型名貴淡水經濟魚類——洛氏鱥(Rhynchocypris lagowskiiDybowski)[2,18,19],探討不同C/N行成的生物絮團對急性銅暴露洛氏鱥免疫抑制、炎癥反應與氧化應激的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

洛氏鱥購于九臺區泉源魚苗養殖場, 飼養于吉林農業大學水產研究室玻璃水族箱中, 暫養2周使其適應環境, 期間投喂商品日糧(通威飼料有限公司, 粗蛋白36%、粗脂肪8.0%、粗纖維4.0%和粗灰分6.4%)使其適應基礎料。根據我們課題組之前發表[2,18—20]培養生物絮團與調節C/N的方法, 選擇無水葡萄糖粉(99.97%)為外加碳源, 按照C/N不同設置4個實驗組: 對照組(C/N 10.8∶1)、Ⅱ組(C/N 15∶1)、Ⅲ組(C/N 20∶1)和Ⅳ組(C/N 25∶1)。

1.2 飼養管理

在實驗開始前, 停食24h, 選取480尾規格一致,體質健壯的洛氏鱥幼魚(10±0.15) g, 隨機分入12個玻璃缸中(100 L水), 每缸40尾, 期間水溫控制(18±2)℃, 按2%—3%投餌率日投喂2次(9:00和18:00), 每日19:00向魚缸中添加葡萄糖粉。24h不間斷曝氣充氧, 每周測量溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽和總磷等, 確保各項水質指標均符合洛氏鱥的生長條件。在8周飼養實驗結束后, 進行96 h的急性攻毒脅迫實驗, 根據前期研究, 銅暴露洛氏鱥的半致死濃度為1.03 mg/L[2], 向各實驗組添加調配好濃度的無水硫酸銅(CuSO4)。攻毒期間的實驗條件與飼養實驗條件一致, 但是并未投喂。

1.3 樣品收集及測定方法

水質指標與水體中銅濃度實驗期間使用多參數水質測試儀YSI556測定水質指標; 絮團體積采用 Imhoff 錐形管法測定; 總體懸浮物使用TOYO定量濾紙抽濾發測定; 在銅暴露實驗結束前后, 分別從每個魚缸中取5 mL養殖水體與10 mL濃硝酸(65%HNO3)混合, 經消化作用72h后, 4℃離心10min(12000×g), 最后, 取上清液用AA-6300原子吸收光譜儀測定銅的濃度。

生長性能在飼養實驗結束后, 停食24h, 每桶隨機選取洛氏鱥10尾, 測其體長和體質量, 用于各項指標的測。特定生長率、增重率、存活率和飼料轉化率的測試方法參考Long等[8]和Yu等[18—20]。

免疫、抗氧化與炎癥反應指標在脅迫實驗結束后, 從每缸隨機取洛氏鱥10尾, 經MS-222(200 mg/L)麻醉后用2.0 mL肝素鈉注射器尾靜脈采血, 血樣 4℃離心10min(5000 r/min)收集血清,–20℃保存待測。

AKP、ACP(對硝基苯磷酸鹽法)、LSZ(比濁法)、NOS(硝酸還原酶法)、C3、C4、IgM(免疫比濁法); CAT(可見光測定法)、ASA(比色法)、SOD(黃嘌呤氧化酶法)、T-AOC(ABTS速測法)、GSHPX(二硫代二硝基苯甲酸法)、GR(紫外分光光度法)和MDA(TBA法); TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6采用雙抗體夾心ELISA 法, 具體參照Yu等[2,19,20]。以上試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

1.4 統計分析

結果以平均數±標準差表示。采用SPSS(20.0)軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA), 以確定顯著性差異, 再用Tukey’s多極差檢驗比較均值(P＜0.05), 確定差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同C/N生物絮團對養殖水體水質的影響

如表 1所示, 各組水溫、脅迫后CuSO4濃度無顯著差異(P＞0.05); Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組pH、溶解氧、氨氮和亞硝酸鹽顯著低于對照組(P＜0.05), 且各組之間差異不顯著(P＞0.05); Ⅲ和Ⅳ組總磷與透明度顯著低于對照組(P＜0.05), 其互相之間差異不顯著(P＞0.05)。相反的是: Ⅲ和Ⅳ組絮團體積與總體懸浮物顯著高于對照組(P＜0.05), 而Ⅲ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長性能的影響

如表 2所示, Ⅲ和Ⅳ組末體質量、特定生長率和增重率顯著高于對照組, 而飼料轉化率顯著高低于對照組(P＜0.05), 且Ⅲ和Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05); Ⅱ和Ⅲ組的存活率顯著高于對照組與Ⅳ組(P＜0.05)。

2.3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫酶活力的影響

由圖 1可知, 生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫抑制具有一定的緩解作用, 其中: Ⅲ組各項免疫酶活力均顯著高于對照組(P＜0.05), Ⅳ組的ACP和補體C3, Ⅱ組的ACP、補體C4與IgM含量也顯著高于對照組(P＜0.05)。LSZ與AKP活力在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05); NOS活力在Ⅱ和Ⅳ組和對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥炎癥因子的影響

由圖 2可見, 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥的炎癥反應具有不同的緩解效果, 其中Ⅲ組和Ⅳ組TNF-α與IL-1β含量顯著低于對照組, 且這兩組之間差異不顯著(P＞0.05); IL-6含量在各實驗組(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)中均顯著低于對照組(P＜0.05), 且Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05); 關于IL-2的含量, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中Ⅲ組含量最高, Ⅱ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05)。

表 1 不同C/N生物絮團對養殖水體水質的影響Tab. 1 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on aquaculture water quality

表 2 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長性能的影響Tab. 2 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on growth performance of R. lagowskii

2.5 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥抗氧化酶的影響

由圖 3可見, 生物絮團對銅暴露洛氏鱥氧化應激具有一定的緩解作用, 其中: Ⅲ和Ⅳ組SOD、GR和GSH-PX活性均顯著高于對照組(P＜0.05), 然而它們之間無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比,Ⅱ組的T-AOC和ASA含量差異不顯著(P＞0.05), 但是Ⅲ和Ⅳ組顯著升高, 且Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組(P＜0.05); 各實驗組(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)中的CAT活性均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中Ⅲ組呈最大值, Ⅱ組與Ⅳ組無顯著差異(P＞0.05); MDA含量隨著碳氮比的升高, 呈下降趨勢, 當C/N 15(Ⅲ組)時達到最低值, 之后略有回升。與對照組相比,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組均顯著下降(P＜0.05), 但是Ⅱ和Ⅳ組差異不顯著, Ⅲ和Ⅳ組也無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長及養殖水體水質的影響

大量研究表明, 生物絮團可促進養殖動物的生長, 凈化養殖水體, 當C/N適當時, 魚類表現出最佳的生長趨勢[6,8,16,17]。本實驗結果顯示, 隨著C/N的升高, 洛氏鱥的增重率和特定生長率呈上升趨勢,說明在本實驗條件下, 高碳氮比形成的生物絮團有效地促進了洛氏鱥的生長; Ⅲ組飼料轉化率顯著低于對照組, 表明C/N20:1時形成的絮凝物可作為洛氏鱥的天然餌料, 并且可以連續在原位獲得額外的蛋白質、脂肪、礦物質和維生素, 以加快生長進度,與Wang等[17]所得結果基本吻合。Ⅳ組雖然在末體重、增重率與特定生長率上都出現最高值, 但在存活率上卻與對照組不相上下, 究其原因可能是C/N過高, 導致異養菌大量增殖, 總體懸浮物含量過飽和, 堵塞魚鰓, 不利于魚類呼吸。

Avnimelech[21]研究表明, 當水體C/N為15.75以上時, BFT能顯著凈化水質污染問題。從本文結果來看: 隨著C/N的升高, 溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽、總磷、透明度及脅迫后CuSO4濃度均呈下降趨勢。溶解氧下降是由于微生物繁殖生長消耗大量氧氣[16]; pH下降可能是洛氏鱥和微生物生長,呼吸放出的CO2增多, 導致廢物累積和酸敗[22];Hari等[23]指出額外添加碳源可有效降低水體里的氨氮、亞硝酸鹽與總磷的濃度, 原因可能是生物絮團對含氮污染物的快速異養轉化[16], 與本文結果相似; 透明度持續下降是因為飼料的不斷投入與異樣菌大量繁殖[19]; 攻毒后CuSO4濃度下降, 可能是絮團對水體中銅的吸附、沉降等作用引起的[2]。

圖 1 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清免疫酶的影響Fig. 1 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum immune enzymes of R. lagowskii in waterborne copper exposure

圖 2 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清炎癥因子的影響Fig. 2 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum inflammation factors of R. lagowskii in waterborne copper exposure

3.2 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫抑制的緩解作用

免疫指標是監測環境危害對魚類健康潛在影響的重要參數, 作為抵御病原微生物的第一道防線,非特異性免疫與先天免疫系統在保護魚類健康方面起著至關重要的作用[2,24—26]。LSZ作為非特異性免疫系統的重要組成部分, 能水解病原菌中的黏多糖, 分解細菌細胞壁上肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-(1, 4)糖苷鍵, 在清除侵襲性病原體和細菌方面發揮著至關重要的作用[27],AKP和ACP是參與動物免疫的一種重要水解酶, 在免疫應答過程中能增強血細胞識別異物, 改變病原體表面結構[19,20]。NOS能幫助巨噬細胞對抗免疫系統中的病原體[2]。在本實驗中, 第Ⅲ組中的LSZ、AKP、ACP和NOS活力顯著高于對照組, 表明當養殖水體中C/N為20∶1時, 能顯著緩解銅暴露洛氏鱥的免疫抑制, 增強其對環境脅迫的抗性。而當C/N為15∶1與25∶1時, LSZ、AKP和NOS活力與對照組無顯著差異, 這可能是由于低C/N絮團或過高C/N絮團對銅暴露洛氏鱥的免疫酶影響不大。Liu等[28]研究生物絮團增強羅非魚擁擠脅迫耐受能力, 結果顯示C/N20∶1組顯著提高了LSZ和AKP活力, 與本實驗結果大致吻合。補體C3和C4是參與體液免疫的大分子, 可以通過溶解免疫球蛋白復合物殺死病毒和細菌, 促進炎癥反應[29]。IgM是衡量魚類體液免疫功能的重要指標[30]。在本實驗中, 在不同C/N生物絮團對洛氏鱥補體C3、C4和IgM的影響略有不同, 但總體趨勢皆為先升高后趨于平緩。與對照組相比, 第Ⅲ組中的補體C3、C4和IgM水平顯著升高。以上結果可能是由于, 魚類攝食或生存于不同C/N形成的生物絮團環境中, 而一定范圍之內, 高C/N生物絮團內含有多種微生物、益生菌和生物活性物質, 可以提高魚類免疫酶活性, 并通過次生代謝產物使宿主受益[31,32]。同時, 它們的細胞成分或代謝物(類胡蘿卜素等)可以作為免疫刺激劑, 改善先天免疫系統并提供對宿主的保護[2,9]。此外, 高C/N生物絮團還能通過促進魚類生長, 誘導其消化道微生物區系的變化, 獲得提高免疫力和抵御環境應激的能力[20]。

圖 3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清抗氧化酶的影響Fig. 3 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum antioxidant enzymes of R. lagowskii in waterborne copper exposure

3.3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥炎癥反應的緩解作用

魚類的免疫功能與炎癥密切相關, 炎癥是由細胞因子介導和啟動的, 已有實驗表明重金屬銅可誘導頭腎免疫相關基因轉錄和細胞應激反應的改變[33]。細胞因子是一組多肽類細胞調節物質, 包括白細胞介素、腫瘤壞死因子和細胞刺激因子等, 主要由外周免疫細胞合成。眾所周知, IL-1β和TNF-α是2種強大的促炎因子, 可通過調節其他細胞因子的表達來誘導炎癥反應[34]。IL-2可促進T淋巴細胞增殖和分化, 誘導和增強致死性T細胞、單核細胞和巨噬細胞的活性; IL-6和IL-1共同促進T細胞增殖并參與炎癥和發熱[35]。在本研究中, 當C/N≥20∶1時, BFT顯著降低了銅暴露洛氏鱥血清的IL-1β、IL-6和TNF-α水平, 升高了IL-2水平。這表明高C/N生物絮團能有效緩解洛氏鱥銅暴露所引起的炎癥反應, 與Yu等[18]利用BFT緩解氨脅迫引起的洛氏鱥炎癥反應結果相似。究其結果可能是由于高碳氮比BFT系統中能形成大量有益菌群, 有益菌群通過產生有機酸、細菌素或爭奪營養物質抑制有害菌的繁殖, 還可抑制有害菌產生內毒素和致癌物質, 降低炎癥因子水平, 從而實現免疫調節作用[2,9]。同時, BFT中的益生菌(芽孢桿菌、乳酸菌和丁酸梭菌等)能進入魚類腸道, 通過代謝物或表面抗原刺激魚類免疫體系, 與有害菌競爭營養和附著位點, 保護魚類免受病原菌侵染, 進而增強魚類非特異性免疫力[36,37]。此外, BFT系統中水生微生物的微生態平衡可以有效控制氨氮和亞硝酸鹽, 降低條件性病原微生物致病的幾率[38]。

3.4 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥抗氧化應激的緩解作用

生物體具有復雜而又精密的抗氧化防御系統,在一定范圍內, 可以及時有效地清除重金屬積累產生的活性氧(ROS), 減少脂質變化引起的細胞損傷,保護細胞免受氧化應激的傷害[1—3,26]。眾所周知,內源性抗氧化酶, 包括SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX、GR和ASA是抵御氧化應激的第一道防線[2,19,20,39]。Xu等[40]研究表明, 絮團組在血漿與肝胰臟中出現相對較高的SOD與T-AOC活性, 而GSH-PX活性與對照組差異不顯著。Chen等[15]研究結果顯示: 高C/N下生物絮團能顯著提高仿刺參體液SOD、CAT和GSH-PX活力。Yu等[20]研究表明,當C/N=20∶1時, 生物絮團能有效提高黃金鯽肝胰臟、腸道與腎臟中SOD、CAT、GSH-PX與T-AOC活性, 降低MDA水平。且在我們實驗組的前期發現中, C/N 20∶1形成的生物絮團對洛氏鱥各個組織(鰓、腦、腎、脾、肝和腸)的抗氧化酶活性均有不同程度的提高[19]。在本實驗中, 與對照組相比, 除MDA外, 銅暴露洛氏鱥血清抗氧化酶(Ⅲ和Ⅳ組)均顯著提高, 相反的是, MDA含量顯著降低。這表明在C/N≥20∶1情況下, BFT可以有效提高抗氧化酶活性, 降低脂質變化引起的超氧化物損傷, 緩解洛氏鱥經銅暴露而引起的一系列氧化應激反應。這個發現可能是由于高C/N形成的生物絮團降低了洛氏鱥的脂質過氧化水平, 誘導洛氏鱥具有更強的抗氧自由基能力, 提高了其對抗環境脅迫的能力及成活率[2,16,25]。此外, BFT中含有大量的天然微生物和生物活性生長因子, 包括胡蘿卜素、葉綠素、植物甾醇、多酚、多糖、牛磺酸和維生素, 也能增強魚類的應激反應和抗氧化功能[19,20,22]。

4 結論

綜上, 在不同C/N水平下形成的生物絮團對銅暴露洛氏鱥的免疫抑制、炎癥反應與氧化應激有不同的影響。當C/N=20∶1時, 生物絮團能顯著提高銅暴露洛氏鱥免疫酶(AKP、ACP、LSZ、NOS、C3、C4和IgM)活力和抗氧化酶(CAT、ASA、T-AOC、SOD、GSH-PX和GR)活力, 降低MDA含量, 穩定炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-2和IL-6), 從而有利于洛氏鱥緩解銅暴露引起的應激反應。