紙基微流控芯片檢測方法研究進展*

劉 溢，王 英，姜鈺婷，胡 晨，劉春葉，張 劍

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

紙基微流控芯片，是一種集成化、便攜化、低成本化的檢測技術。紙芯片可追溯到17世紀，英國化學家波義耳偶然發現紫羅蘭濺到鹽酸會變紅，由此發明了石蕊試紙。2007年，Whitesides團隊首次提出紙基微流控芯片技術的概念，隨后紙基微流控芯片已經得到了快速發展。2009年，張釗[1]繼2008年美國亞利桑那大學研制出第1張折紙芯片后，開發出新型DNA折紙芯片；2011年，王方方等[2]采用光刻法制備一維和二維紙芯片，驗證了紙芯片上化學發光法檢測葡萄糖和尿酸的可能性；2012年Maejima Kento[3]等提出了利用噴墨打印技術制作紙芯片，研制出了低成本、可大量生產、能在家進行血液檢測的紙芯片；同年，Xie Li等[4]通過噴墨打印電極技術制作出混合可穿戴的生物傳感系統，為新一代可穿戴的健康監測技術提供了有力支持；2013年，馬翠翠[5]研發出一種基于紫外光降解自組裝單分子層的紙芯片新型加工法；同年，寇娟[6]提出用魯米諾-過氧化氫化學發光體系測定藥物，嚴偉等[7]利用微流控紙芯片研究乳腺癌組織；2014年，貴金屬及其氧化物的納米材料開始廣泛運用于紙芯片的制作與檢驗[8-11]；2015～2016年紙芯片的新型制作方法層出不窮[12-16]，如回形針固定法、3D打印法、離子體法等；2017～2020年人們開始關注紙芯片與智能手機的結合[17-19]以及如何進一步提高檢測精度與速度[20-22]等問題。

現如今，紙基微流控芯片已廣泛運用于食品安全檢測[23-27]、醫藥[28-33]、環境檢測[34]等各領域。相比較于其他方法，紙芯片具有可大規模生產、易于攜帶、檢測迅速、不需要專業人員、大型配套設施分析，結果分明可直接觀察等突出優勢。

1 紙基微流控芯片的檢測方法

目前，紙芯片的發展已較成熟，檢測方法眾多，但應用最廣泛的大致有比色法、熒光法、化學發光法、電化學法4種。

1.1 比色法

比色法是將檢測對象加入到檢測體系，構建相關的顯色反應進行檢測的，通過顯色時間、體系pH值、檢測溫度、物質濃度等因素來衡量檢測的有效程度。實際操作中，通常都會使用純化、富集或濃縮后的檢測溶液或根據實際情況加入顯色劑，以達到更理想的比色效果。

1.1.1 食品安全檢測

食品安全問題一直都是熱點，將比色法用于食品檢測大大增加了檢測的便利性和實用性。呂聰聰等[35]利用三聚氰胺對H2O2的催化作用，使辣根過氧化氫酶-3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(HRP-TMB)-H2O2體系在同一時間顏色加深，通過觀察紫外可見吸收曲線測定出三聚氰胺的檢出限為5 μmol/L；張一冉等[36]通過挑選出9種對三甲胺靈敏的指示劑，制作出氣敏紙芯片，對不同時期鱸魚肉的揮發性氣體進行檢測，成功辨別出不同儲存時間段的鱸魚肉；Lung-ming Fu等[37]利用熱塑性聚酯紙芯片和SO2發生酸堿反應，通過高分辨率的相機和紅綠藍(RGB)分析軟件檢測分析，結果表明食物中φ(SO2)=10×10-6～300×10-6，φ(SO2)與RGB色度值具有很高的線性關系(R2=0.998 1)，該結果與傳統方法的偏差小于3.82%。

1.1.2 蛋白質檢測

蛋白質的檢測在食品、醫藥領域都很重要，采用比色法的優點在于該方法操作簡單，可進一步推行到日常生活中。李秀平[38]等通過紫外光刻技術制作紙芯片，利用體積為0.2 μL、質量濃度為10 mg/mL的溴酚藍作為指示劑檢測尿液中總蛋白含量，檢測時間控制在5 min以內，經過量化由顯微鏡電荷耦合器件(CCD)拍攝芯片圖像的灰度用來執行半定量，檢測限為2.1 mg/L,定量限為6.9 mg/L，回收率為96.7%～103.82%。

1.2 熒光法

熒光法利用檢測對象與相應的熒光材料作用產生熒光，運用熒光光譜法、熒光光度法等進行定量分析，是目前使用最廣泛的一種檢測方法。同時，熒光法與液相色譜法的結合能進一步精確實驗數據，也為熒光法的運用帶來更多可能性。

1.2.1 重金屬檢測

隨著人類活動的擴大，食物、環境中的重金屬含量增加，有效檢測重金屬，確保人類健康生活這一問題在生活中日漸突出，采用熒光法檢測重金屬是很好的選擇。孫覓覓[39]基于紫脲酸銨(Mu)與鎘離子相互作用產生紫外可見光譜的變化，檢測出鎘離子檢測范圍為0～35 μmol/L，紫外檢測限為0.21 μmol/L,并成功用于大米中鎘離子的檢測；陳綺嫻[40]以鹽酸多巴胺為碳源，鄰苯二胺為修飾劑將熒光碳納米材料與紙芯片結合，發現該材料對Hg2+具有高選擇性，ρ(Hg2+)=0.04～0.610 μg/mL，對Hg2+表現出良好的線性響應,檢出限低至0.000 6 μg/mL(S/N=3，n=6)；王冠等[41]以玻璃纖維紙為基體，碲化鎘量子點為熒光響應材料，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)為單體，正硅酸四乙酯(TEOS)為交聯劑在玻璃紙表面分別合成鎘和鉛離子印跡聚合物，檢測出鎘離子的線性范圍為0.05～80.0 μg/L,檢出限為0.01 μg/L；鉛離子的線性范圍為0.10～78.0 μg/L，檢出限為0.03 μg/L。實際樣品檢測的回收率分別為98.0%～104.0%和99.4%～103.4%；Junrui Zhou等[42]首次利用離子印刷技術將新型熒光量子點ZnSe應用于3D紙基微流控芯片，用來單獨或同時檢測鎘離子和鉛離子。檢測出該紙芯片對鎘離子的檢測范圍為1～70 μg/L，最低限為0.245 μg/L；鉛離子的檢測范圍為1～60 μg/L，最低限為0.335 μg/L。

1.2.2 蛋白質檢測

同樣，熒光法也可用于蛋白質的檢測。郭小艷[43]利用紙芯片免疫分析方法檢測免疫球蛋白，采用順序噴墨打印技術測定免疫球蛋白(IgG)的檢出限為0.4 ng/mL；陳瑩[44]利用量子點信號標記物實現了對癌胚抗原(CEA)和前列腺蛋白(PSA)的檢測，測定出線性范圍分別為1.0～40.0 ng/mL和1.0～45.0 ng/mL，檢出限分別為0.3 ng/mL和0.4 ng/mL。

1.2.3 農藥檢測

農業生產上使用農藥，在一定程度上提高了農產品的產量，但是超標的農藥殘留同樣對環境、人體有不同程度的危害，所以應該密切關注農產品中農藥的殘留量。楊鋮[45]將能識別目標農藥的適配體與基于熒光內濾效應(IFE)的金納米(AuNPs)-量子點(CdTe QDs)體系相結合，并與最優的混合區通道組合，檢測出該系統對啶蟲脒的檢測范圍為50～600 μg/kg；對丙溴磷的檢測范圍為60～480 μg/kg，均低于國標中的農藥最大殘留限量。

1.3 化學發光法

化學發光法是檢測對象與檢測體系之間經過反應發光，通過分析發光時間、發光強度等因素得出檢測結論的一種方法。采用化學發光法，要合理選擇背景，通過優化各項條件使發光強度穩定，發光時間便于檢測，減少干擾。臨床上利用化學發光法檢測腫瘤、病毒等效果大多優于放射免疫法、酶聯免疫法。目前已有公司利用化學發光法制作試劑盒來檢測新冠肺炎病毒。

1.3.1 蛋白質檢測

化學發光法檢測蛋白質常用于醫療領域，該方法具有較高的精確性。于麗娟[46]基于甲胎蛋白上所標記的辣根過氧化物酶(HRP)能催化魯米諾-過氧化氫化學發光體系發光，通過分析發光強度與甲胎蛋白(AFP)濃度的關系，檢測出了實際血清中的AFP；劉蒙蒙[47]基于血紅蛋白質和肌紅蛋白質都含有血紅素分子，能作為催化劑使魯米諾-過氧化氫體系發光，實現了對蛋白質定性低檢測限的分析。

1.3.2 化學物質檢測

Hideyuki Matsuura等[48]利用噴蠟打印法將發光的報告蛋白固定在紙芯片上一排反應圈中，該紙芯片能用于人全血中氨基糖苷類物質的檢測，利用樣品檢測的數碼相機檢測發光信號，檢測結果在30～60 min呈現。該芯片為氨基糖苷類藥物抗生素的檢測治療提供了新思路，適用于不發達地區。

1.4 電化學法

電化學法是通過在紙芯片上建立電極，檢測樣品加入時能產生電流，在相關檢測儀器的處理下分析出結果的方法。該方法具有較高的靈敏度，能進行高質量的檢測，同時設計紙芯片時通?？紤]電極材料、電壓大小、反應時間、溶劑配比、樣品添加量等常見因素，制作思路較清晰。

1.4.1 離子檢測

離子的檢測不同于其他化合物較簡單的檢測，目前人們大多從離子帶電這一角度入手，采用電化學法進行檢測。于涵等[49]通過滴涂導電碳漿及Ag/AgCl漿，分別制備了固態聚合物膜鈣離子選擇性指示電極和固態聚合物膜參比電極，用于海水中Ca2+的檢測，結果為在0.5 mol/L NaCl背景下，該系統在c(Ca2+)=1.0×10-4～3×10-2mol/L呈現線性響應,響應斜率為24.3 mV/dec；溫雪飛[50]利用離子濺射儀在銅版紙表面電沉積金，再在銅版紙(Au/paper)電極表面修飾多壁碳納米管(MWCNTs)，加熱烘干后制得MWCNTs/Au/paper工作電極，實現了對塑料樣品中重金屬鉻和二酚基丙烷的檢測；Wang Xiaoqing等[51]利用磁控濺射法在硝化纖維紙上構建出了一個三電極系統，利用方波溶出伏安法檢測Cu2+，在ρ(Cu2+)=5～200 μg/L、200～1 000 μg/L顯示出99.58%和98.87%的良好線性，該方法檢測最低限為2 μg/L，同時也適用于Zn2+、Cd2+、Pd2+、Bi3+等離子的檢測。

1.4.2 化學物質的檢測

電化學法也能根據實際情況用于其他化合物的檢測。Dhouha jemmeli等[52]利用炭黑修飾的墨水制作出的納米紙芯片對雙酚A有高度敏感性，通過方波伏安法，檢測出河水以及飲用水中的雙酚A含量均符合相關標準；楊文韜等[53]研發出一種基于濃差電池原理的紙芯片，通過與智能手機的結合實現了對三氯磷酸酯的快捷、可自供電的定量檢測，檢出限為0.89 μmol/L。

1.5 電化學發光法

電化學發光法是電化學法和化學發光法的結合，使結果更明顯的同時也能適用于平時檢測難度較大的對象，目前使用電化學發光法的資料較少，該方法也因此具有巨大潛力。王嘉偉[54]研制出一種在紙基上進行的酶催化反應，結合智能手機作為檢測的新型電化學發光系統，可用于經濟不發達地區人民健康檢測；Yu Chen等[55]研發出一種基于電化學發光法通過生物傳感器檢測乙肝表面抗體的紙芯片，利用循環伏安法和電化學發光法，得出線性范圍為34.2 pg/mL～34.2 ng/mL，該紙芯片相比于其他方法具有更高的選擇性和敏感性。

1.6 其他方法

1.6.1 光電檢測法

近年來光電檢測法也逐漸適用于紙芯片，該方法通常結合其他檢測方法一起使用，也為紙芯片后續的檢測提供了新思路。楊寧[56]等通過構造橋式復合結構提升微流控酶抑制顯色反應的均勻度，設計出集化學反應、光吸收反射效應和環境參數控制于一體的農藥檢測系統，該方法分辨率達0.002 mg/L，與YPS-1168型便攜式農藥檢測儀檢出限相當，但試劑消耗價格降低了94.79%，時間縮短了23%；李振[57]基于酶抑制生化反應在紙基微流控芯片上檢測的基本原理，引入反射式光電檢測和熒光光電檢測技術，在進行了信息采集、公式采集、誤差分析之后，運用反射式光電檢測的紙基微流控芯片(RPPMC)法和面向熒光檢測的紙基微流控芯片(FPMC)法分別檢測敵百蟲時對應的相關系數為0.982和0.996，檢出限為0.010和0.007 mg/L；檢測對硫磷時對應的相關系數為0.984和0.978，檢出限為0.014和0.012 mg/L。

1.6.2 一體化檢測模型

傳統紙芯片檢測方法分為檢測和分析2個步驟，一體化檢測模型借助于不同儀器將檢測和分析過程一次完成，提高了紙芯片的簡便性。Ruey-Jen Yang等[58]基于3D紙基微流控芯片制作出一種新型一體化檢測模型，用于檢測人全血樣品中白蛋白的濃度。檢測時首先在紙芯片檢測區域添加溴甲酚綠(BCG)，并將該模型儲存在15 ℃的氮氣環境中；然后加入10 μL全血樣品，樣品會與BCG反應，加熱使溫度上升至37 ℃，反應時間為6 min。結果表明，模型分析結果與標準結果(R2=0.983 7和R2=0.996 8)一致，該一體化模型可用于白蛋白的快速檢測。

綜合比較以上方法，可總結出紙芯片常用4種方法的特點，見表1。

表1 紙芯片常用4種檢測方法的特點

2 結束語

紙芯片因其具有低成本、便攜性、檢測快速、結果分明、無需高端檢測設備與技術人員等優點可大量運用于不發達地區以及日常生活中。在紙芯片的檢測方法中，比色法、熒光法、化學發光法操作簡單，結果易分辨，適用于日常檢測及自我檢測；電化學法制備紙芯片有一定難度，使用受限，需要相關儀器配合使用，通常用于專業性的離子檢測。紙芯片在醫療方面的疾病診斷、藥物含量檢測、食品安全方面的有害物質檢測、環境方面的污染物檢測等有很大的應用前景。

隨著社會需求的變化，關于優化紙芯片檢測，應該考慮設計出更加靈敏、一體化、多功能、有效期長、便于儲存的紙芯片。還可以考慮能否用紙芯片代替更多傳統的檢測，特別是在疾病檢測，健康保健方面可加強與智能手機的聯系，將紙芯片推廣進日常生活中，為人們帶來更多便利。