LRP8在胃癌中的表達及其在胃癌發生過程中的作用

劉 斌，鄭鵬遠，米 陽，任飛飛，高 爽，劉 傳，李發展

1.鄭州大學第五附屬醫院消化內科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學醫學科學院，河南 鄭州 450052

胃癌在所有腫瘤中發病率位居第五，死亡率位居第三［1］。胃癌每年超過一半發生在中國，是中國男性死亡率位居前列的癌癥［2］。目前對胃癌的病因已有較為明確的結論，但是其發病機制仍未完全明確［3］。從分子層面來說，胃癌的發生涉及多個癌基因和抑癌基因、信號轉導通路和細胞周期調控分子的變異等復雜過程［4］。本研究探討低密度脂蛋白受體相關蛋白8（low-density lipoprotein receptor-related protein 8，LRP8）在胃癌組織與正常胃黏膜中是否存在差異表達，LRP8對胃癌細胞生物學行為的影響，并探尋其可能的機制及其與胃癌患者臨床病理學特征及預后的關系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 數據庫資料收集分析

在人類癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫下載384例胃癌和3 7 例正常人的基因表達數據，在cbioportal（https://www.cbioportal.org）數據庫中下載T C G A 數據庫中具有完整臨床病理學信息的240例胃癌患者數據，在基因表達匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫中下載GSE13911［5］、GSE13861［6］的基因表達數據集，分析胃癌組織和正常胃黏膜中LRP8的表達差異。利用R（pheatmap）與R（corrplot）軟件包分析與LRP8的共表達的基因，進一步通過DAVID分析工具對共表達基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析；在Kaplan-Meier plotter（www.kmplot.com）數據庫中分析LRP8表達與胃癌患者預后的相關性。

1.1.2 標本來源

鄭州大學第五附屬醫院2018年8月—2019年7月行全胃切除術或部分切除術的患者25例，其中男性17例，女性8例，年齡（63.6±11.4）歲，所有患者術前均未接受化療和放療。采用免疫組織化學法檢測LRP8在胃癌組織中的表達。胃癌細胞系AGS購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，常規傳代培養。

1.1.3 實驗試劑

兔LRP8抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，鼠β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，RPMI-1640及Opti-MEM培養基、TRIzol購自美國Gibco公司，FBS胎牛血清購自美國Biological Industries公司。人源LRP8小干擾RNA（small interference，siRNA）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，si-LRP8-1序列為5’-GCAGCCAGAU CUGUGUCAATTUUGACACAGAUCUGGCUG CTT-3’，si-LRP8-2序列為5’-GGAGAAACUGG AAGCGGAATTUUCCGCUUCCAGUUUCUCC TT-3’。LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，發光液購自美國Advansta公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）引物由中國金唯智生物科技有限公司合成，反轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司，RTFQPCR試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 數據分析

在TCGA數據庫中下載胃癌組織基因表達值，分析384例胃癌患者胃癌組織和37例健康人胃組織中LRP8基因表達差異。利用生物信息學功能注釋數據平臺DAVID，對胃癌中與LRP8表達正相關的前200個基因進行GO分析和KEGG分析。TCGA數據庫中240例胃癌患者，取LRP8表達值中位數為界分為高表達和低表達組，然后分析臨床病理學特征與LRP8表達的關系。利用Kaplan-Meier plotter數據庫中找到LRP8表達的芯片數據并繪制LRP8表達的生存曲線。

1.2.2 免疫組織化學檢測

組織切片分別放于二甲苯、無水乙醇中脫蠟、脫苯；加入檸檬酸鈉抗原修復15 min。用3%過氧化氫去離子水和山羊血清依次封閉15 min，兔LRP8一抗（1∶100）4℃溫育過夜。次日洗去一抗，采用50 μL生物素化二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素依次溫育20 min，二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）染色2 min，蘇木精復染細胞核1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。空白對照組使用抗體稀釋液溫育，其余處理相同。結果采用德國半定量評分法進行評分［7］。具體參考本研究團隊之前發表的文章［8］。

1.2.3 細胞培養及細胞轉染

使用含10%FBS的RPMI-1640培養基，于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養AGS細胞。細胞以1×105個鋪到12孔板，次日轉染：12孔板更換 800 μL無血清培養基，然后每孔中加入預先混勻的200 μL opti-MEM+2.5 μL LipofectamineTM2000+5 μL陰性對照或si-RNA。輕輕搖晃，置于培養箱中。8 h后更換含血清及抗生素的完全培養基1 mL。轉染48 h后收取細胞用于后續實驗。

1.2.4 細胞功能實驗

細胞增殖：細胞以1 000個每孔鋪到96孔板中，置于培養箱中培養0、24、48、72 h后，分別更換含10%CCK-8的完全培養基，溫育2 h后，多功能酶標儀測定450 nm處的吸光度（D）值并進行統計學分析。細胞遷移：1×105個細胞用 200 μL無血清培養基重懸后加入transwell培養板的上室，下室中加入600 μL完全培養基，放入上室，置于培養箱溫育48 h。移除培養基，用棉簽擦去上室未遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，用0.1%結晶紫染色30 min后再用PBS洗去染色液。隨機選取5個100倍鏡視野，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 RTFQ-PCR檢測

RNA按TRIzol法提取后，按反轉錄試劑盒說明書操作進行，于37 ℃、15 min反轉錄反應和 98 ℃、5 min的酶失活反應后得到cDNA，稀釋10倍后作為模板配置RTFQ-PCR體系，分別加入10 μL 2 ×SYBR Green PCR Master Mix、2.8 μL引物混合物（上、下游引物均為5 μmol/L）及5.2 μL無酶水，最后加入2 μL cDNA模板，95 ℃活化2 min，兩步循環95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸10 s，循環次數為40。所得結果采用2-△△C(t)法計算相對表達量，具體參考本研究團隊之前發表的文章［8］。引物信息如表1所示。

表1 RTFQ-PCR的引物序列Tab 1 Primer sequences for RTFQ-PCR analysis

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）

按照試劑盒說明書的方法制備SDS-PAGE凝膠，電泳按照80 V 30 min、100 V 60 min兩步法進行，結束后取出凝膠，制作轉膜三明治結構，按300 mA、90 min恒流電轉。取出NC膜，置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加入兔LRP8抗體（1∶1 000）、鼠β-actin抗體（1∶5 000），4 ℃溫育過夜。次日取出回收一抗充分清洗后二抗室溫溫育1 h，結束后充分清洗，Bio-RAD曝光儀曝光拍照分析。具體參考本研究團隊之前發表的 文章［8］。

1.3 統計學處理

TCGA數據庫中LRP8表達值采用兩獨立樣本校正t檢驗。GEO數據庫中LRP8表達值采用GEO2R在線分析方法，adj.P＜0.05且｜log2 FC｜＞2（adj.P為調整后的P值，FC為差異倍數）代表差異有統計學意義。免疫組織化學評分結果用 SPSS 22.0軟件進行統計學分析，LRP8相對表達量免疫組織化學數據采取配對符號秩和檢驗，與臨床病理學特征關聯采用Fisher確切概率法檢驗，TCGA數據庫中病理學特征采取卡方檢驗或連續校正卡方檢驗。生存分析采用log-rank檢驗。以上實驗數據，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LRP8在胃癌組織中高表達

分析TCGA數據庫中384例胃癌患者腫瘤組織和37例正常人胃黏膜組織中LRP8的表達數據，結果顯示，在胃癌組織中LRP8表達高于正常胃黏膜，差異有統計學意義（t=8.928，P＜0.000 1，圖1）。而GEO數據庫中，其中GSE13861顯示在彌漫型胃腺癌中LRP8表達高于正常胃黏膜（t=9.062，P＜0.000 1）；而GSE13911中數據顯示腸型胃腺癌中LRP8表達高于正常胃黏膜（t=10.081，P＜0.000 1）。第3項研究中分析混合型腺癌（t=5.738，P＜0.000 1）和腸型胃腺癌（t=6.754，P＜0.000 1）中LRP8表達高于正常胃黏膜，差異有統計學意義（P＜0.000 1，圖1）。

圖1 TCGA和GEO數據庫中LRP8在胃癌中的表達情況Fig.1 LRP8 expression is upregulated in gastric cancer in TCGA and GEO datasets

2.2 LRP8在胃癌中與其他基因表達的共聚類分析

TCGA數據庫中分析384例胃癌患者基因表達數據的共聚類分析顯示，LRP8與LOC100507564、SAPCD2、ODF2、E2F1、SLC1A5等20個基因有較高的共表達（圖2A），最高的5個相關系數分別為0.68、0.60、0.54、0.54和0.53（圖2B）。提示LRP8可能與這些基因在功能上有相似性。

圖2 胃癌組織中與LRP8表達相關基因的關聯性分析Fig.2 Correlation analysis of the gene expression level of LRP8 in gastric cancer

2.3 LRP8功能富集分析

為了研究LRP8在胃癌中發揮何種功能，我們對胃癌中與LRP8表達正相關的200個基因進行基因功能的GO功能富集分析，發現LRP8在分子功能上富集在DNA指導的RNA聚合酶活性、中性氨基酸的跨膜轉運蛋白活性等基因功能上；而在細胞功能上則富集在細胞內膜結合細胞器、核仁、核膜上；在生物學功能上，富集在與RNA轉錄延伸聚合酶Ⅱ啟動子、mRNA剪接、rRNA的加工等基因功能上。KEGG通路富集顯示，LRP8參與Wnt信號轉導通路激活（圖3）。

圖3 TCGA數據庫樣本中LRP8的GO和KEGG通路富集分析Fig.3 GO and KEGG pathway enrichment analyses of 384 gastric cancer patients from TCGA database

2.4 LRP8敲低影響胃癌細胞功能

為了研究LRP8表達對胃癌細胞功能的影響，我們通過RNA干擾技術敲低AGS細胞的LRP8，通過RTFQ-PCR及Western blot來驗證敲低效率，結果顯示，LRP8表達成功下調。隨后我們進行了細胞增殖實驗和細胞遷移實驗。結果發現，在AGS細胞中，si-LRP8組細胞增殖率均低于對照組；細胞遷移實驗結果顯示，si-LRP8組AGS細胞遷移率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 LRP8表達影響胃癌細胞AGS遷移Fig.4 LRP8 expression affects AGS cell migration

2.5 LRP8敲低抑制Wnt通路活性

為了分析LRP8對Wnt通路活性的影響，我們通過RTFQ-PCR分析了LRP8敲低后Wnt經典通路的下游靶基因，發現LRP8敲低后伴隨Wnt通路下游關鍵靶基因表達的蛋白β-catenin、LRP5、POU5F1、CCND1、AXIN2的表達下調（圖5）。

圖5 LRP8敲低對Wnt信號通路下游靶基因的影響Fig 5 Effect of LRP8 knockdown on downstream target genes of Wnt signaling pathway

2.6 胃癌中LRP8高表達與患者不良預后的關系

我們進一步分析Kaplan-Meier plotter數據庫中LRP8表達水平與胃癌患者預后的數據，通過Affy ID:205282-at和208433_s_at兩個基因芯片的數據繪制了LRP8高低表達組的生存曲線（圖6）。LRP8高表達患者的總生存期和無疾病進展生存期均低于低表達組（P＜0.05，表2），提示LRP8高表達可能與胃癌不良預后相關。

表2 LRP8表達與胃癌患者OS及FPS的關系Tab.2 Correlation of LRP8 expression with OS and FPS of gastric cancer patients

圖6 LRP8高表達與胃癌患者不良預后相關Fig.6 High LRP8 expression predicted poor prognosis in gastric cancer patients

2.7 胃癌組織中LRP8的高表達與患者臨床病理學特征的關系

對25例胃癌患者及其癌旁組織進行的免疫組織化學檢測結果顯示，LRP8在胃癌組織中高表達，陽性率為70.83%，差異有統計學意義（Z=-3.535，P＜0.001）。進一步分析胃癌組織中LRP8表達與患者臨床病理學特征之間的關系（表3），發現LRP8表達與胃癌分期相關（P=0.034）。

表3 免疫組織化學分析LRP8表達與胃癌患者臨床病理學特征的關聯Tab.3 Correlation between LRP8 expression and clinicopathological features of gastric cancer in immunohistochemistry data(n)

進一步分析表明Ⅲ、Ⅳ期胃癌中LRP8表達更高，而與患者年齡（P=0.063）、性別（P=0.626）、分化程度（P=0.648）、浸潤深度（P=0.267）及淋巴結轉移（P=0.560）等無相關性。但對TCGA數據庫中LRP8表達與胃癌患者臨床特征分析表明（表4），LRP8表達與胃癌患者年齡呈正相關（P＜0.001），與患者性別（P=0.096）、腫瘤浸潤深度（P=0.342）、淋巴結轉移（P=0.306）、遠端轉移（P=0.260）及分期（P=0.775）無相關性（圖7）。

表4 TCGA數據分析LRP8表達與胃癌患者臨床病理學特征的關聯Tab.4 Correlation between LRP8 expression and clinicopathological features of gastric cancer in TCGA dataset(n)

圖7 具有代表性的胃癌患者腫瘤組織及癌旁組織LRP8免疫組織化學檢測結果Fig.7 Representative immunohistochemistry staining of LRP8 in tumor tissues and paracancerous tissues of gastric cancer patients

3 討 論

低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）家族成員包括LDLR及LDLR相關蛋白，如LRP1、LRP2、apoER2/LRP8、LRP3、LR P4、LR P5、LR P6以及LR32/LR P1B［9］。雖然同屬一個家族，但是它們在不同的生理活動中發揮不同的效應。由于癌細胞比正常細胞需要更多的膽固醇攝取，因此通過LDLR介導的血清LDL內吞作用提高肺癌細胞內膽固醇含 量［10］。LDLR還被報道通過促進腫瘤細胞的遷移和增殖促進癌癥進展［12-13］。其中LRP5、LRP6、LRP8已被廣泛證明在多種腫瘤的發生過程中起重要作用［13-17］。

LRP8由7個保守的低密度脂蛋白A重復序列和3個表皮生長因子受體樣結構域和β-螺旋結構組成。但關于LRP8和胃癌的關系，鮮見文獻報道。我們的研究關注LRP8在胃癌中的表達及其對胃癌細胞功能之間的影響，以便尋求新的胃癌診治靶點。本研究通過分析TCGA、GEO和Kaplan-Meier plotter數據庫中的信息，來探討LRP8在胃癌中的表達情況及其表達對胃癌患者預后的影響。我們發現，在TCGA數據庫和3項研究中，胃癌組織中LRP8呈高表 達［5-6，17］，共表達分析發現，LRP8與LOC100507564、SAPCD2、ODF2、E2F1、SLC1A5等20個基因有較高的共表達，進一步對表達呈正相關的前200個基因進行GO通路富集分析，LRP8在分子功能上富集在DNA指導的RNA聚合酶活性等信號轉導通路，而KEGG富集分析發現LRP8富集到Wnt信號轉導通路，從而可能通過調節Wnt信號轉導通路來影響腫瘤細胞遷移、增殖和腫瘤進展。因此，我們研究了LRP8敲低對胃癌細胞生物學行為的影響，發現沉默LRP8表達后，AGS細胞體外增殖率及細胞遷移率均下降。為了驗證LRP8是否調節Wnt信號轉導通路，我們進一步檢測LRP8敲低對經典Wnt信號轉導通路下游靶基因的影響，發現伴隨LRP8的敲低，其下游β-catenin、LRP5、POU5F1、CCND1、AXIN2的表達均出現一致性的下調，進一步證實了我們的推測。而Kaplan-Meier Plotter數據庫中有兩項基因芯片結果表明胃癌患者中LRP8高表達與患者不良預后相關［18］。最后通過對25例胃癌患者的腫瘤組織及其癌旁組織的免疫組織化學檢測來進一步驗證LRP8表達與胃癌患者臨床病理學特征的相關性，發現LRP8在胃癌組織中高表達，且與胃癌分期呈正相關。對TCGA數據庫中240例胃癌患者臨床信息的分析發現LRP8表達與患者年齡呈正相關，而與腫瘤分期無關。

我們的研究證實了胃癌中LRP8的高表達與胃癌患者的遠期生存率下降相關，提示LRP8可作為胃癌患者預后不良的生物學標志物，并可能成為胃癌靶向治療新的分子靶點。