circMTO1表達與miR-3200/PEBP1軸的關系及其預測內鏡黏膜下剝離術后復發的價值*

李本杰，周倩，彭志紅

[1.貴黔國際醫院消化內科，貴州貴陽550018；2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院（西南醫院）消化內科，重慶400038]

胃癌早期診斷與治療是消化道惡性腫瘤領域的研究熱點，早期胃癌的病變局限于黏膜層或黏膜下層，手術切除治療的預后良好，且5年生存率超過90%[1]。近些年，消化內鏡診療技術在我國得到了推廣，早期胃癌診斷率不斷提升，內鏡下手術也被越來越多的用于早期胃癌的治療，內鏡下黏膜切除術（endoscopic mucosal resection，EMR）和內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）是常用的兩種內鏡下手術方式，目前認為，ESD的整塊切除率和組織學治愈性切除率較EMR明顯提高，術后復發率明顯降低[2-5]，但ESD術后仍有2.3%～3.2%的復發率[2-3]。如何早期預測早期胃癌ESD術后復發的風險，并針對存在復發高風險的患者進行嚴密隨訪，是臨床關注的問題。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類閉合環狀結構RNA，經選擇性剪接產生，具有保守程度高、不易被核酸外切酶降解和在體內能夠穩定存在的特點，是用于疾病診斷及病情評估的理想分子標志物。近年來，circRNA在惡性腫瘤發生發展中的作用受到越來越多的關注。circRNA能夠吸附微小RNA（microRNA，miR），并阻礙miR對靶基因的調控，進而起到促癌或抑癌作用[6]。HU等[7]研究表明，circMTO1對胃癌的發生發展具有抑制作用，可能的機制是靶向結合miR-3200并促進抑癌基因磷脂酰乙醇胺結合蛋白1（phosphatidyl ethanolamine binding protein 1，PEBP1）的表達。在此基礎上，本研究將以接受ESD治療的早期胃癌患者為對象，進一步分析circMTO1表達與miR-3200/PEBP1軸的關系及其預測ESD術后復發的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月－2018年7月在陸軍軍醫大學第一附屬醫院（西南醫院）接受ESD治療的早期胃癌患者485例。其中，男273例，女212例，年齡45～70歲，平均（56.81±12.11）歲。另取同期在本院接受胃鏡檢查取胃黏膜進行病理活檢，并證實為正常胃黏膜的112例受試者作為對照組，既往均無惡性腫瘤病史。其中，男67例，女45例，年齡43～68歲，平均（58.14±16.25）歲。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

入組標準：①均接受ESD治療；②經病理學檢查診斷為早期胃癌；③臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標準：①術前接受放化療；②術后接受放化療；③既往有其他惡性腫瘤病史。

本研究取得入組患者知情同意及醫院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 circMTO1表達檢測采用熒光定量PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進行circMTO1表達檢測：①提取RNA后反轉錄為cDNA，配置PCR反應體系：cDNA 2 μL、試劑盒內的Mixture 10.0 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.6 μL、去離子水補足至20.0 μL，所用引物分別為目的基因circMTO1及內參基因β-actin的特異性引物；②在PCR儀上按照95℃預變性3 min、而后95℃5 s和60℃15 s重復40個循環的程序進行PCR反應；③得到循環曲線后以β-actin為內參計算circMTO1的表達水平。

1.2.2 miR-3200表達檢測采用熒光定量PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進行miR-3200表達檢測：①提取miRNA后反轉錄為cDNA，配置miR的PCR反應體系：cDNA 2.0 μL、試劑盒內的Mixture 10.0 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.6 μL、去離子水補足至20.0 μL，所用引物分別為目的基因miR-3200及內參基因U6的特異性引物；②在PCR儀上按照95℃預變性3 min、而后95℃5 s和60℃15 s重復40個循環的程序進行PCR反應；③得到循環曲線后以U6為內參計算miR-3200的表達水平。

1.2.3 PEBP1表達檢測采用Western Blot檢測PEBP1的表達：①用蛋白裂解液提取早期胃癌組織及正常胃黏膜組織中的蛋白；②測定蛋白濃度，并根據測定結果將含有30 μg蛋白的樣本用于Western Blot實驗；③按照實驗流程進行電泳、電轉PVDF膜、封閉、孵育一抗及二抗，所用一抗分別為1∶1 000稀釋或1∶2 500稀釋的，根據一抗種屬選擇相應二抗；④最后在凝膠成像系統中進行PVDF膜顯影，得到PEBP1及β-actin的條帶及吸光值，以β-actin為內參計算PEBP1的表達水平。

1.3 術后隨訪

于術后3、6和12個月（此后每年1次）以門診復查的方式進行隨訪，起始時間為ESD手術當天，截止日期為2020年6月30日，門診復查內容包括腫瘤標志物、CT和消化內鏡檢查，記錄患者的復發情況：根據《早期胃癌內鏡下規范化切除的專家共識意見（2018，北京）》[1]，術后6個月以上原切除部位以及周圍1 cm內發現腫瘤病灶為復發。

1.4 統計學方法

選用SPSS 21.0軟件統計數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較行t檢驗，兩計量資料間的相關性采用Pearson檢驗進行分析，無復發生存情況采用Kaplan-Meier曲線描述并進行Log rank檢驗，無復發生存的影響因素采用COX回歸模型進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較

早期胃癌組circMTO1和PEBP1表達水平明顯低于對照組，miR-3200表達水平明顯高于對照組，兩組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 Western Blot檢測早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中PEBP1的表達Fig.1 The expression of PEBP1 in early gastric cancer tissue and normal gastric mucosa tissue detected by Western blot

表1 兩組患者circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較（x±s）Table 1 Comparison of circMTO1、miR-3200 and PEBP1 expression between the two groups（±s）

表1 兩組患者circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較（x±s）Table 1 Comparison of circMTO1、miR-3200 and PEBP1 expression between the two groups（±s）

組別早期胃癌組（n=485）circMTO1 0.75±0.23 miR-3200 1.01±0.32 PEBP1 0.69±0.21對照組（n=112）t值P值1.04±0.22 12.12 0.000 0.69±0.18 10.21 0.000 0.94±0.27 10.72 0.000

2.2 早期胃癌組circMTO1、miR-3200和PEBP1表達相關性

經Pearson檢驗，早期胃癌中circMTO1表達水平與miR-3200呈負相關，miR-3200表達水平與PEBP1呈負相關，circMTO1表達水平與PEBP1表達水平呈正相關。見圖2。

圖2 早期胃癌組circMTO1、miR-3200和PEBP1表達的相關性Fig.2 Correlation of circMTO1，miR-3200 and PEBP1 expression in early gastric cancer group

2.3 早期胃癌組不同臨床病理特征circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較

早期胃癌組性別、年齡和分化程度的circMTO1、miR-3200和PEBP1表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移情況和脈管癌栓情況的circMTO1、miR-3200和PEBP1表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 早期胃癌組不同臨床病理特征circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較（x±s）Table 2 Comparison of the expression of circMTO1，miR-3200 and PEBP1 in different clinicopathological characteristics of early gastric cancer group（±s）

表2 早期胃癌組不同臨床病理特征circMTO1、miR-3200和PEBP1表達比較（x±s）Table 2 Comparison of the expression of circMTO1，miR-3200 and PEBP1 in different clinicopathological characteristics of early gastric cancer group（±s）

類別性別circMTO1 t值P值miR-3200 t值P值PEBP1 t值P值男（n=273）女（n=212）年齡≥60歲（n=294）＜60歲（n=191）腫瘤直徑＜2 cm（n=278）≥2 cm（n=207）浸潤深度黏膜層（n=314）黏膜下層（n=171）分化程度分化（n=264）未分化（n=221）淋巴結轉移否（n=376）是（n=109）脈管癌栓否（n=392）是（n=93）0.77±0.25 0.73±0.22 1.84 0.066 0.99±0.26 1.04±0.36 1.78 0.077 0.71±0.26 0.67±0.21 1.82 0.077 0.74±0.26 0.77±0.23 1.30 0.195 1.00±0.27 1.04±0.37 1.37 0.170 0.71±0.24 0.68±0.19 1.46 0.146 0.81±0.28 0.67±0.19 6.21 0.000 0.84±0.26 1.24±0.35 14.51 0.000 0.75±0.24 0.61±0.18 7.05 0.000 0.82±0.26 0.62±0.17 9.06 0.000 0.85±0.24 1.30±0.36 16.44 0.000 0.74±0.25 0.60±0.19 6.39 0.000 0.76±0.26 0.74±0.22 0.90 0.367 0.99±0.27 1.02±0.35 1.06 0.288 0.71±0.25 0.67±0.20 1.92 0.056 0.78±0.27 0.63±0.20 5.39 0.000 0.92±0.25 1.33±0.39 13.12 0.000 0.72±0.24 0.58±0.17 5.69 0.000 0.78±0.28 0.61±0.19 5.56 0.000 0.94±0.28 1.30±0.37 10.43 0.000 0.72±0.25 0.56±0.16 5.89 0.000

2.4 早期胃癌組無復發生存率與circMTO1、miR-3200和PEBP1表達的關系

對入組的485例早期胃癌患者進行了ESD術后隨訪，共17例出現復發，復發率為3.51%。Kaplan-Meier曲線分析顯示，circMTO1高表達的早期胃癌患者無復發生存率高于circMTO1低表達患者，miR-3200高表達的早期胃癌患者無復發生存率低于miR-3200低表達患者，PEBP1高表達的早期胃癌患者無復發生存率高于PEBP1低表達患者。見圖3。

圖3 無復發生存率與circMTO1、miR-3200和PEBP1表達的關系Fig.3 Relation between relapse-free survival and expression of circMTO1，miR-3200 and PEBP1

3 討論

早期胃癌是指僅局限于黏膜層或黏膜下層無論是否發生淋巴結轉移的胃癌。目前，消化內鏡下手術是臨床上治療早期胃癌的常用手段，手術方式包括EMR和ESD兩種。ESD是在EMR基礎上改良而來的手術方式，最大的優勢是操作不受病灶大小的限制，能夠整塊切除病灶。國內外的多項臨床研究[2-5]發現，ESD治療早期胃癌的整塊切除率和組織學治愈性切除率均高于EMR，術后復發率則低于EMR。雖然ESD治療早期胃癌的臨床價值確切，但仍有部分患者會出現復發，根據白順滟等[2]和王偉等[3]的研究結果，早期胃癌ESD術后復發率分別為3.2%和2.3%。因此，研究早期胃癌復發的分子機制及預測標志物具有重要的臨床意義。早期預測早期胃癌ESD術后復發的風險、篩查可能發生復發的高?；颊卟⒓訌婋S訪，有助于及時發現并進行干預，進而改善患者預后。

circRNA是近幾年惡性腫瘤發病機制研究的熱點分子，能夠作為內源性競爭性RNA與miR結合，阻礙miR對下游靶基因的負調控作用，實現對原癌基因或抑癌基因表達的調控，從而發揮促癌或抑癌作用。circRNA除了參與癌細胞表達和癌細胞惡性生物學行為的調控外，還能作為評價病情及預后的分子標志物。circMTO1是一種具有抑癌作用的circRNA，胃癌、乳腺癌和肺癌相關的基礎研究[7-9]表明，circMTO1對癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性行為學具有抑制作用。另有研究[10]發現，circMTO1在結直腸癌病灶內的表達明顯降低。本研究發現，早期胃癌組circMTO1的表達水平明顯低于對照組，提示circMTO1低表達可能與早期胃癌發病有關，與該circRNA介導的抑癌效應吻合。

筆者在發現circMTO1低表達可能與早期胃癌發病有關后，進一步分析了circMTO1與早期胃癌術后復發的關系。本研究中，早期胃癌ESD術后復發率為3.51%，與文獻[2-3]報道接近。有研究[11-14]報道，浸潤深度、淋巴結轉移和脈管癌栓等病理特征的改變是早期胃癌復發的影響因素。本研究顯示，隨著腫瘤直徑增大、浸潤深度加深、淋巴結發生轉移和脈管癌栓形成，早期胃癌中circMTO1表達則明顯減少，提示circMTO1低表達與早期胃癌惡化有關。進一步分析circMTO1與早期胃癌復發的關系，Kaplan-Meier曲線分析顯示，隨著circMTO1表達降低，早期胃癌患者的無復發生存率也明顯降低，表明circMTO1低表達不僅與早期胃癌發病有關，還與早期胃癌發展和ESD術后復發有關。

HU等[7]報道，circMTO1抑制胃癌惡性生物學行為的分子機制是靶向結合miR-3200和增加PEBP1表達。PEBP1又名Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP），是重要的抑癌基因，通過誘導細胞周期停滯、促進細胞凋亡、抑制細胞增殖和侵襲來發揮抑癌作用[15-17]。張曉梅等[18]的細胞實驗證實，PEBP1過表達能夠調控胃癌細胞的增殖、凋亡和侵襲。WEI等[19]研究發現，胃癌中PEBP1表達明顯減少。本研究利用早期胃癌患者的臨床樣本及隨訪資料，對circMTO1參與早期胃癌發生發展的機制進行了初步探究。本研究中，miR-3200表達增加而PEBP1表達減少，且miR-3200及PEBP1表達變化均與腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移和脈管癌栓等有關，也與ESD術后復發有關，表明miR-3200/PEBP1軸在早期胃癌的發生發展中起到重要作用。筆者進行相關性分析發現，早期胃癌中circMTO1與miR-3200呈負相關、而miR-3200與PEBP1又呈負相關，由此推測，circMTO1低表達引起了miR-3200表達增加，miR-3200高表達又抑制了PEBP1表達，進而削弱PEBP1抑癌作用，并促進了早期胃癌的發生發展。

本研究觀察了circMTO1在早期胃癌發生、發展和術后復發中的作用，并通過相關性分析初步探討了circMTO1發揮作用的分子機制。結果表明，早期胃癌中circMTO1表達降低與病情發展和ESD術后無復發生存時間縮短有關，靶向miR-3200/PEBP1軸是可能的分子機制，circMTO1/miR-3200/PEBP1軸有望成為研究早期胃癌發生及復發機制的靶點，circMTO1也有望成為預測復發的標志物。