麝香保心丸對小鼠缺血性腦卒中的保護作用及機制

邵 帥 陳彥霖 地里熱巴提·地力木拉提 賈 鋒

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科 上海 200127）

腦卒中包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高且復(fù)發(fā)率高［1］，已成為危害居民健康的常見難治性疾病。在我國，腦卒中引起的死亡率和致殘率由1990年的第三位上升到2017年的首位［2］。缺血性腦卒中在我國腦卒中患者中占69.6%～70.8%［3-4］。缺血性腦卒中是大腦血管閉塞引起的腦組織缺血、缺氧和壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［5］。近年來，機械取栓術(shù)治療缺血性腦卒中已取得巨大進步，但由于取栓時間窗的局限性，僅可對少數(shù)患者進行有效救治［6］，目前藥物治療僅限于重組組織纖溶酶原激活劑［7］，因此研發(fā)新的有效治療手段勢在必行。

麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill，SBP）的組成（質(zhì)量百分比）為麝香6%、人參提取物27%、牛黃4%、肉桂24%、蘇合香酯8%、蟾酥4%及冰片19%，具有芳香溫通、益氣通心的功效，是一種多靶點、多作用途徑的治療藥物［8］。作為一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，SBP可有效緩解心絞痛、改善血流動力學(xué)，已廣泛用于治療心血管疾病［9］。目前關(guān)于SBP治療急性缺血性腦卒中的臨床研究較少，在動物實驗方面尚未見報道。本實驗通過建立小鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，觀察SBP對小鼠缺血性腦卒中產(chǎn)生的影響，并探索其中的分子作用機制，以期為SBP治療缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

材料和方法

主要實驗試劑及儀器本研究中96只健康雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可號：SCXK（滬）2017-0011，體質(zhì)量22～25 g。飼養(yǎng)條件：12 h的明暗循環(huán)，平均室溫約24℃，相對濕度約50%，自由進食和飲水。動物實驗符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理相關(guān)規(guī)范。

SBP（上海和黃藥業(yè)有限公司），線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazole chloride，TTC）、戊巴比妥鈉（美國Sigma公司），GAPDH抗體（美國Cell Signaling Techonology公司），Iba-1抗體、NF-κb p-p65抗體（美國Abcam公司），免疫熒光（immunofluorescence，IF）二抗、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒、Western blot二抗（美國Thermo公司），DAPI染色試劑盒、細胞核蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒、山羊血清、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green（日本TaKara公司），qRT-PCR引物［鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司］。

體式顯微鏡、石蠟切片機、激光共聚焦顯微鏡（德國Leica Microsystems公司），組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），酶標(biāo)儀、NanoDropTM分光光度計（美國ThermoFisher公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Aplegen公司）。

實驗分組與給藥將C57BL/6小鼠隨機分為假手術(shù)（Sham）組，模型（ischemia/reperfusion，I/R）組、低劑量（22.5 mg/kg）麝香保心丸（low-dose SBP，LSBP）組、高劑量（45 mg/kg）麝香保心丸（high-dose SBP，HSBP）組，每組24只，用藥劑量參考文獻報道［10］。用生理鹽水配置成混懸液，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥4周，分別給予假手術(shù)與MCAO手術(shù)。

MCAO模型的建立參考文獻［11］建立MCAO模型。小鼠稱重，50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，行左側(cè)MCAO手術(shù)。動物四肢及頭部固定于木板上，沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。在體式顯微鏡下，首先在頸總動脈近心端打一活結(jié)，再在頸內(nèi)動脈遠心端打一活結(jié)，接著結(jié)扎頸外動脈遠心端，在近心端打一松結(jié)，并在兩個結(jié)之間做斜切口，快速插入線栓，使之頭端稍微超過頸外動脈松結(jié)的位置，此時將頸內(nèi)動脈處活結(jié)松開，并調(diào)整線栓的進線方向，使線栓頭部沿頸內(nèi)動脈進入，緩慢推動，直至有少許阻力感，停止推動線栓，并在頸內(nèi)動脈處打活結(jié)固定線栓。1 h后緩慢退出線栓，將頸外動脈近心端結(jié)扎，松開頸總動脈活結(jié)，實施血流再灌注。逐層縫合皮膚，將動物放回籠中，待其自然蘇醒，正常飲食。手術(shù)期間，用加熱墊使肛溫維持在（37.0±0.5）℃。術(shù)后動物出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)或前肢癱瘓則用于實驗，單純手術(shù)而未進線栓的動物作為假手術(shù)組。

TTC染色造模24 h后，用異氟烷麻醉小鼠，采取心臟灌流法，用生理鹽水將小鼠血液排出，隨后處死小鼠（每組6只），取腦組織。將腦組織和大腦切片槽，置于-20℃冰箱15 min后，行冠狀位切片，厚度為2 mm/片，切好的腦片放入2%染液中，避光置于37℃恒溫箱15 min，取出腦片，攝像。用Image J軟件計算梗死面積并定量。

腦組織含水量按上述方法處理小鼠，取完整的左側(cè)腦組織，用電子天平稱取濕重，放入恒溫電熱干燥箱（105℃）烘烤72 h，稱取干重。按Elliott公式計算腦組織含水量：含水量（%）=（濕重-干重）×100%/濕重。

免疫熒光染色按上述方法處理小鼠，再緩慢灌注4%多聚甲醛，取小鼠腦組織，去除嗅球及小腦，4%多聚甲醛浸泡過夜。二甲苯和梯度酒精行透明和脫水處理，再行石蠟包埋，制作厚度5μm的冠狀切片，55℃烘箱過夜。第二天，用二甲苯和梯度酒精行脫蠟，檸檬酸和檸檬酸鈉行抗原修復(fù)，5%山羊血清溶液37℃恒溫箱封閉1 h，孵育Iba-1（1∶100，英國Abcam公司）抗體稀釋液4℃過夜，次日PBS清洗3次，每次5 min，最后DAPI室溫孵育5 min，封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察梗死側(cè)Iba-1的表達情況。

qRT-PCR按上述方法處理小鼠，取左側(cè)腦組織，放入1.5 mL無酶離心管中，加入1 mL TRIZOL和預(yù)冷的磁珠，用組織研磨儀將組織打碎。加入200μL氯仿，手動劇烈搖晃1 min，4℃下12 000×g離心15 min，將上清吸至另一離心管，加入等體積異丙醇，手動劇烈搖晃1 min，4℃下12 000×g離心10 min，白色RNA沉淀在管底，去上清，加入1 mL用DEPC水配置的75%乙醇溶液，4℃下7 500×g離心5 min，去上清，室溫晾干20 min。加入適量DEPC水，吹打數(shù)次，溶解RNA。用Nanodrop測定樣本濃度，再利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）按說明書將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，最后將cDNA稀釋至50μL，用于qRT-PCR檢測。按Syber Green試劑盒說明書配制實時熒光定量反應(yīng)體系，加入熒光定量專用384孔板中進行反應(yīng)，根據(jù)循環(huán)數(shù)檢測基因表達水平。qRT-PCR引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司提供（表1）。

Western blot按上述方法處理小鼠，取左側(cè)腦組織，放入1.5 mL無酶離心管中，加入磁珠和含有PMSF的RIPA溶液，用組織研磨儀將組織打碎。按照細胞核蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒說明書，抽提細胞核蛋白質(zhì)。依據(jù)BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒說明書，測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白質(zhì)濃度，加入相應(yīng)的SDS蛋白質(zhì)Loading緩沖液，混勻后放入100℃金屬浴恒溫器加熱10 min，置于冰上。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將PVDF膜加入TBST中，搖床晃動1 min，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，最后用TBST洗膜3遍，每遍5 min。將PVDF膜放入超靈敏多功能成像儀中，加入顯影液，反應(yīng)后曝光得到不同目的條帶，采用Image J軟件分析蛋白質(zhì)灰度值。

表1 qRT-PCR的基因引物序列Tab 1 Prime sequencesin qRT-PCR

統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，定量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間數(shù)據(jù)差異比較采用One-way ANOVA法分析，采用GraphPad Prism 5.0軟件制作柱狀圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MCAO模型建立4組小鼠連續(xù)灌胃4周后，建立MCAO模型，并在24 h后取材（圖1）。

SBP對小鼠腦梗死體積的影響每組取6只小鼠，正常狀態(tài)下小鼠無腦梗死。造模后，與Sham組相比，經(jīng)TTC染色，I/R組梗死體積明顯大于Sham組（P<0.001）。經(jīng)SBP灌胃預(yù)處理4周后，LSBP組和HSBP組梗死體積均明顯小于I/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LSBPvs.I/R，P=0.002；HSBPvs.I/R，P<0.001），且SBP對梗死體積減小具有劑量正相關(guān)性，HSBP組梗死面積小于LSBP組梗死體積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005）。因此，SBP可以減少缺血性腦卒中引起的梗死體積（圖2A～C）。

圖1 小鼠實驗分組以及MCAO模型建立Fig 1 Experimental grouping and establishment of MCAO model

SBP對小鼠腦組織含水量的影響每組取6只小鼠，與Sham組相比，I/R組腦組織含水量明顯高于Sham組（P<0.001），提示I/R組腦組織水腫程度大于模型組。經(jīng)SBP灌胃預(yù)處理4周后，與I/R組相比，LSBP組和HSBP組腦組織含水量均明顯少于I/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LSBPvs.I/R，P=0.007；HSBPvs.I/R，P<0.001），且SBP對腦水腫的改善與劑量正相關(guān)，HSBP組腦水腫程度輕于LSBP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.036）。因此，SBP可以緩解缺血性腦卒中引起的腦水腫（圖2D）。

SBP對激活小膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響每組取6只小鼠，經(jīng)IF檢測，與Sham組相比，I/R組Iba-1+細胞數(shù)量明顯增加（P<0.001），Iba-1可作為激活小膠質(zhì)細胞的標(biāo)記物［12］，這提示I/R組激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加。在缺血性腦卒中的急性期，大量激活的小膠質(zhì)細胞提示炎癥反應(yīng)加重。經(jīng)SBP灌胃預(yù)處理4周后，與I/R組相比，LSBP組和HSBP組Iba-1+細胞數(shù)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LSBPvs.I/R，P=0.007；HSBPvs.I/R，P<0.001），且SBP對小膠質(zhì)細胞激活的抑制作用具有劑量正相關(guān)性，HSBP組Iba-1+細胞數(shù)量少于LSBP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.041）。因此，SBP可以減少缺血性腦卒中后激活小膠質(zhì)細胞的數(shù)量（圖3）。

SBP對炎癥因子表達的影響每組取6只小鼠，經(jīng)qRT-PCR檢測，與Sham組相比，I/R組M 1型和M 2型小膠質(zhì)細胞標(biāo)志性炎癥因子（M 1型：TNF-α、I L-1β、MCP-1、CXCL 1；M 2型：Arg-1、Ym-1、Mgl1、Fizz1）表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（A rg-1：P=0.001 7；其他P均<0.001），提示炎癥反應(yīng)加重。經(jīng)SBP灌胃預(yù)處理4周后，與I/R組相比，LSBP組和HSBP組M 1型小膠質(zhì)細胞標(biāo)志性炎癥因子表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（IL-1β：LSBPvs.I/R，P=0.0047；MCP-1：LSBPvs.I/R，P=0.009；CXCL 1：LSBPvs.I/R，P=0.044；其他P均<0.001）。且SBP對M 1型炎癥因子表達的抑制作用具有劑量正相關(guān)性，HSBP組M 1型炎癥因子表達水平低于LSBP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（TNF-α：P<0.001；IL-1β：P=0.031；MCP-1：P=0.007；CXCL 1：P=0.028）。與I/R組 相 比 ，LSBP組 和HSBP組M 2型炎癥因子表達水平均有所增加，部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Arg-1：LSBPvs.I/R，P=0.067，HSBPvs.I/R，P=0.0083；Ym1：LSBPvs.I/R，P=0.036，HSBPvs.I/R，P<0.001；Mgl1：LSBPvs.I/R，P=0.014，HSBPvs.I/R，P=0.004；Fizz1：LSBPvs.I/R，P=0.193，HSBPvs.I/R，P=0.047）。因此，SBP可以促進小膠質(zhì)細胞由M 1型向M 2型極化（圖4）。

圖2 SBP減少小鼠缺血性腦卒中引起的梗死體積和腦水腫程度Fig 2 SBPreduced the infarct size and infarct volume and cerebral edema caused by ischemic strokein mice

圖3 SBP減少小鼠缺血性腦卒中后激活小膠質(zhì)細胞的數(shù)量Fig 3 SBPreduced the number of activated microglia caused by ischemic stroke in mice

SBP對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)水平的影響每組取6只小鼠，經(jīng)Western blot檢測，與Sham組相比，在細胞核內(nèi)I/R組p-p65/p65水平明顯增高（P<0.001）。經(jīng)SBP灌胃預(yù)處理4周后，LSBP組和HSBP組p-p65/p65的水平都有所減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（LSBPvs.I/R，P=0.007；HSBPvs.I/R，P<0.001），且SBP對p-p65/p65的抑制作用具有劑量正相關(guān)性，HSBP組p-p65/p65水平低于LSBP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008）。因此，SBP可以抑制細胞核內(nèi)NF-κB通路的激活，從而減輕缺血性腦卒中帶來的炎癥反應(yīng)（圖5）。

圖4 SBP促進小鼠缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細胞由M 1型向M 2型極化Fig 4 SBPpromoted M 1 pro-inflammatory phenotype to M 2 anti-inflammatory phenotype polarization in microglia caused by ischemic stroke in mice

圖5 SBP抑制小鼠缺血性腦卒中引起的NF-κB信號通路激活Fig 5 SBPattenuated the activation of NF-κB signaling pathway caused by ischemic stroke in mice

討 論

MCAO模型誘導(dǎo)的小鼠腦卒中是研究缺血性腦卒中的經(jīng)典模型，該方法無需開顱，對動物損傷小，其病理學(xué)改變與人類腦中風(fēng)相似［13］。本研究對8周齡雄性小鼠給予線栓法建立MCAO模型，結(jié)果顯示I/R組小鼠出現(xiàn)梗死體積和腦水腫，大量小膠質(zhì)細胞激活，且引起炎癥風(fēng)暴，這些變化與既往MCAO模型結(jié)果相一致［14］。上述表現(xiàn)在LSBP組和HSBP組中得到緩解，提示SBP可改善缺血性腦卒中引起的腦損傷。

缺血性腦卒中是指由于血管阻塞引起的腦血流循環(huán)障礙，進而引起腦組織缺血缺氧，最終導(dǎo)致組織病理性壞死的一系列過程［15］。腦卒中及缺血后再灌注是復(fù)雜的病理生理性變化，機制錯綜復(fù)雜［16］。有學(xué)者提出，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致缺血性腦損傷的重要因素之一［17］。

SBP是一種多成分、多靶點的復(fù)合中成藥，主要由中藥麝香、人參提取物、蟾蜍、蘇合香脂、冰片、牛黃和肉桂組成［8］。由于SBP具有擴張冠狀動脈、抑制血管壁炎性因子、改善心肌缺血等作用，且安全性高，不良反應(yīng)較少，已經(jīng)廣泛用于冠心病的治療［18］。由于腦血管疾病與心血管疾病有相似的發(fā)病機理，根據(jù)心腦同治原則，將SBP應(yīng)用于腦梗死患者的臨床治療已取得一定的效果［19］。然而，對于SBP治療缺血性腦卒中僅應(yīng)用于部分臨床研究，在動物實驗方面尚無報道。部分缺血性卒中患者會發(fā)生腦心綜合征，嚴(yán)重時可致心律失常和心肌缺血［20］。SBP可有效緩解急性缺血性腦卒中引起的腦心綜合征［21］。本實驗通過觀察SBP對小鼠缺血性腦卒中產(chǎn)生的保護作用，并探索其中的分子機制。對于患有心肌梗死和缺血性腦卒中的人群，以及患有心肌梗死且屬于缺血性腦卒中的高危人群，是否給予SBP治療心肌梗死，并預(yù)防和改善缺血性腦卒中的預(yù)后，值得進一步研究。

在小鼠腦卒中急性期，由于腦組織微環(huán)境缺血缺氧，導(dǎo)致腦組織大量壞死，從而形成梗死面積及腦水腫，這與人的病理生理過程極為相似，可導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷以及顱高壓的形成［11］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SBP可減輕缺血性腦卒中引起的小鼠大腦梗死及腦水腫，從而緩解這一癥狀。

小膠質(zhì)細胞是大腦內(nèi)負責(zé)監(jiān)視和吞噬的固有免疫細胞，由其分泌介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是缺血性腦卒中的重要病理生理機制［22］。在急性缺血性損傷早期，小膠質(zhì)細胞迅速激活，并在短時間內(nèi)迅速聚集在損傷區(qū)域。盡管小膠質(zhì)細胞在缺血性腦卒中里發(fā)揮雙重作用，但是通常認(rèn)為在急性損傷早期，小膠質(zhì)細胞大量激活表明炎癥反應(yīng)加重，而在損傷的慢性期小膠質(zhì)細胞則在修復(fù)過程中起至關(guān)重要的作用［23］。本研究結(jié)果表明，SBP可以抑制小膠質(zhì)細胞的激活，從而抑制級聯(lián)炎癥反應(yīng)，最終減輕腦損傷。小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞一樣，具有兩種表型，即M 1型和M 2型。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，M 1型小膠質(zhì)細胞 主 要 分 泌 促 炎 因 子 ，如TNF-α、IL-1β、MCP-1、CXCL 1；M 2型小膠質(zhì)細胞主要分泌抑炎因子，如Arg-1、Ym-1、Mgl1、Fizz1［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，SBP可以促進小膠質(zhì)細胞由M 1型向M 2型極化，達到減輕炎癥風(fēng)暴的作用。

大量國內(nèi)外研究證明，腦缺血后的組織損傷與NF-κB信號通路的激活密切相關(guān)，NF-κB是NF-κB/Rel蛋白家族成員，廣泛存在于小膠質(zhì)細胞、星型膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞。NF-κB是一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在靜息狀態(tài)時，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合，形成復(fù)合物存在于胞質(zhì)內(nèi)，沒有生物活性，但在缺血缺氧的條件下，NF-κB可以被激活，可誘導(dǎo)IκB蛋白的磷酸化，并通過泛素-蛋白酶體通路將其靶標(biāo)快速降解，釋放NF-κB進入細胞核并與DNA結(jié)合，從而啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄，參與并調(diào)控炎癥反應(yīng)，在缺血性腦卒中的炎癥反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用［25］。本研究發(fā)現(xiàn)SBP可有效減少細胞核內(nèi)NF-κB表達量，從而抑制下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥反應(yīng)，對小鼠缺血性腦卒中引起的腦損傷起到保護作用。

SBP含有多味中藥，其單體化學(xué)成分甚為復(fù)雜，本研究未分離出發(fā)揮主要作用的具體成分，這是我們課題組后期研究方向。綜上所述，SBP可改善小鼠缺血性腦卒中引起的炎癥微環(huán)境，減輕腦組織損傷，緩解腦水腫，從而對損傷的腦組織起到保護作用，其作用機制可能與促進小膠質(zhì)細胞由M 1型向M 2型轉(zhuǎn)化和抑制NF-κB信號通路激活有關(guān)。本研究結(jié)果為SBP在缺血性腦卒中治療中的應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù)，本課題組將繼續(xù)深入研究SBP保護腦組織保護的其他相關(guān)機制。

作者貢獻聲明邵帥 實驗研究，論文撰寫。陳彥霖，地里熱巴提·地力木拉提 實驗設(shè)計，資料分析。賈鋒 實驗指導(dǎo)，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。