準分子激光減容頸動脈粥樣斑塊可行性研究的體外實驗：形態學及產物分析

楊 凱 譚晉韻 鄧 穎 史偉浩 余 波，△

（1復旦大學附屬浦東醫院（上海市浦東醫院）血管外科 上海 201399；2上海市血管病變調控與重塑重點實驗室 上海 201399；3復旦大學附屬華山醫院血管外科 上海 200040）

頸動脈狹窄由頸動脈內膜形成粥樣硬化斑塊導致，是缺血性卒中的首要病因。臨床上解決頸動脈硬化狹窄的主要方式有頸動脈內膜剝脫術（carotid endarterectomy，CEA）與頸動脈造影及支架植入術（carotid angiography and stenting，CAS）兩種。CEA能夠有效去除頸動脈粥樣斑塊，但由于是開放手術，創傷相對較大且伴有神經損傷風險；而微創的CAS并不適合合并主動脈弓部病變的患者，且具有較高的再狹窄發生率［1-3］。目前臨床使用的準分子激光為氯化氙（XeCl）脈沖激光，波長為308 nm，主要應用于下肢動脈及冠脈發生的慢性完全閉塞病變、球囊無法通過及再開通失敗的病變、支架內再狹窄等，國內外并無準分子激光應用于解除頸動脈硬化狹窄的臨床報道，相關體外及動物實驗開展極少且并未關注減容效率及遠端頸動脈供應器官安全性問題［4-5］。本實驗擬在體外開展準分子激光應用于頸動脈硬化狹窄的前期研究，探究準分子激光減容頸動脈斑塊的可行性，著重分析減容效率的同時對產物進行分析。

材料和方法

體外頸動脈粥樣斑塊固定裝置取一長約30 cm、內徑與離體頸動脈粥樣斑塊相適應的透明硅膠管（上海亭芬生物科技有限公司）作為主管道，并在主管道上做一長約4 cm的“H”形切口。取兩段長約1 cm的透明硅膠管，經“H”形切口置入于前后兩端，用于實驗過程中保持頸動脈粥樣斑塊不發生移動。另取一長約5 cm的透明硅膠管，用于封閉主管道的“H”形切口。

頸動脈CTA圖像、頸動脈粥樣斑塊樣品獲取與處理對患有頸動脈硬化狹窄患者且符合外科干預指征的患者行頸動脈內膜剝除術，使用“en bloc”技術獲得完整頸動脈粥樣斑塊6例，用生理鹽水輕柔地洗去血液。將清洗后的頸動脈粥樣斑塊泡入生理鹽水中，4℃冰盒轉運，用于后續實驗。獲取實驗所用頸動脈斑塊對應的頸動脈CTA圖像資料，通過Mimics Medical 21.0軟件獲取動脈管腔的面積、最大卡鉗直徑和最小卡鉗直徑數據。

實驗與數據處理過程激光減容實驗在體外進行。事先預熱準分子激光設備（Spectranetics CVX-300，荷蘭皇家飛利浦公司），設置參數為45 mJ/mm2，25 Hz。將頸動脈粥樣斑塊置入固定裝置中，將0.018″導絲通過斑塊，使用6F Turbo-Elite激光導管（型號420-006，導管直徑2.0 mm，荷蘭皇家飛利浦公司）推進3次，或使用8F Turbo-Elite激光導管（型號425-011，導管直徑2.5 mm，荷蘭皇家飛利浦公司）推進5次。激光導管推進速度小于1 mm/s，同時采用生理鹽水滴注。在完成減容操作后往斑塊固定裝置中輸注生理鹽水并收集，后續經涂片實現對收集到的產物進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在400×倍數下隨機挑選5個視野拍攝HE染色結果圖，并通過ImageJ（Version：1.52t）對圖片內的碎屑進行計數，并收集碎屑的面積、最大卡鉗直徑和最小卡鉗直徑數據。在減容操作后，切取1 mm寬頸動脈粥樣斑塊組織，用2.5%戊二醛溶液固定用于后續的掃描電鏡實驗（場發射掃描電鏡Quanta 250FEG，上海六欣科學儀器有限公司；電壓20.00 kV），觀察減容后頸動脈粥樣斑塊管腔面的微觀結構。減容后剩余頸動脈粥樣斑塊組織用4%多聚甲醛固定，在完成Micro CT（SkyScan1176，布魯克（北京）科技有限公司）拍攝后進行石蠟包埋，隨后進行連續切片（切片厚度為5μm）。一張玻片用于貼附3張切片。在包含頸動脈粥樣斑塊最狹窄部位的1 cm范圍內的切片中，隨機選擇跨越最狹窄部位上下共20張玻片，用于完成HE染色和Masson染色。Micro CT圖像用于獲取減容后斑塊管腔面積、最大卡鉗直徑和最小卡鉗直徑數據。

頸動脈粥樣斑塊病理分型對于頸動脈粥樣斑塊的病理分型，一般采用美國心臟協會制定的標準。但本研究存在確定頸動脈粥樣斑塊病理類型與對斑塊進行減容之間的矛盾，進行美國心臟協會病理分型后的頸動脈粥樣斑塊蠟塊及切片無法滿足減容實驗的需求。所有頸動脈硬化狹窄患者在頸動脈內膜剝脫術術前均未開展頸動脈MRI檢查。故本研究僅能通過減容后的頸動脈粥樣斑塊的HE染色結果對實驗中使用的斑塊樣品進行簡易分型。分型及對應判斷依據如下：脂質斑塊：總脂質核心與斑塊的面積之比≥0.4；或脂質核心距離斑塊管腔<200μm，則放寬總面積標準至30%；鈣化斑塊：總鈣化與斑塊的面積之比≥0.4；或鈣化結節距離斑塊管腔<200μm，則放寬總面積標準至30%；纖維斑塊：上述兩類斑塊排除以后的歸入纖維斑塊這一類型。

統計學分析使用SPSS 26.0軟件進行統計分析。采用Kolmogorov-Smirnov與Shapiro-Wilk正態性檢驗對數據是否符合正態分布進行檢驗。符合正態分布的計量資料以均數或±s表示，不符合正態分布的資料采用中位數及四分位間距表示。符合正態分布的資料采用兩獨立樣本t檢驗進行比較，不符合正態分布的資料采用Mann-Whitney U檢驗進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

準分子激光減容頸動脈粥樣斑塊后管腔面積變化使用6F激光導管減容頸動脈粥樣斑塊后，斑 塊 管 腔 面 積 顯 著 增 加［（0.97±0.39） μm2vs.（5.62±2.05）μm2，P<0.001，圖1H］。斑塊切片（圖1A、B）顯示經6F激光導管減容后，部分斑塊成分被清除，同時發現減容后的斑塊管腔橫截面為不規則形，呈現楔形深入斑塊內部。在換用更大直徑的8F導管并增加推進次數至5次后，斑塊管腔面積同樣顯著增加［（7.29±6.81） μm2vs.（13.67±6.35）μm2，P=0.004，圖1G］。8F導管減容后斑塊管腔橫截面較6F導管減容后的更加規則（圖1C、D）。實驗中我們取同一頸動脈粥樣斑塊，根據術前臨床影像資料在最狹窄部位一切為二。針對其中一段使用8F激光導管進行減容，其后進行石蠟包埋并切片染色，結果如圖1E、F顯示，可見準分子激光去除了較多的斑塊成分。此外，我們觀察到減容區域的邊緣顏色較周邊組織深，但未發現熱損傷后遺留的碳化現象。對管腔面積的最大卡鉗直徑與最小卡鉗直徑進行分析，結果與減容后管腔面積變化相似，經激光減容后，上述兩項直徑均顯著增加（表1）。

表1 6F和8F激光導管各自在減容頸動脈粥樣斑塊后管腔的前后對比Tab 1 Comparison of lumen before and after debulking of carotid atherosclerotic plaque with 6F and 8F laser catheters

圖1 6F與8F激光導管減容頸動脈粥樣斑塊的管腔比較Fig 1 Comparison of lumen after debulking of carotid atherosclerotic plaque by 6F and 8F laser catheters

準分子激光減容頸動脈斑塊的碎屑分析對所有收集到的生理鹽水進行涂片、HE染色，鏡下均可檢出碎屑（圖2A、B）。經8F激光導管減容后，比6F激光導管產生更多的碎屑（6F：3044，8F：4583）。此外，我們收集并整理了碎屑的面積、最大卡鉗直徑及最小卡鉗直徑數據（表2）。兩種管徑的激光導管減容頸動脈粥樣斑塊所產生碎屑的面積都集中在0～10μm2，占比均超過95%（圖2D、G）。對最大卡鉗直徑和最小卡鉗直徑進行分析，呈現出相似的情況（圖2E、F、H、I）。

準分子激光減容頸動脈斑塊后管腔面微觀結構變化頸動脈粥樣斑塊經準分子激光減容后，對斑塊管腔面進行掃描電鏡拍攝，準分子激光減容區域中正常血管內膜消失，同時可見內膜下條索狀纖維暴露（圖2C）。

實驗中使用的頸動脈粥樣斑塊病理類型6F激光導管減容的頸動脈粥樣斑塊病理類型包括脂質斑塊2例、纖維斑塊1例。8F激光導管減容的頸動脈粥樣斑塊病理類型為脂質斑塊3例。兩種尺寸的激光導管均未減容鈣化斑塊這一類型。

表2 6F和8F激光導管在減容頸動脈粥樣斑塊后管腔和碎屑的比較Tab 2 Comparison of lumen and debris between 6F and 8F laser cathetersafter debulking of carotid atherosclerotic plaque

Data is presented in median（interquartile interval）due to non-normal distribution.Feret：The maximum caliper diameter；Minferet：The minimum caliper diameter.ns：Not significant.

圖2 準分子激光減容頸動脈粥樣斑塊的碎屑產物及斑塊腔面微觀形態Fig 2 The debirsproducts of carotid atherosclerotic plaque and the micromorphology of plaque lumen after excimer laser debulking

討 論

臨床上已將準分子激光應用于冠脈及下肢動脈疾病中以解除相應動脈狹窄。準分子激光具有應用于頸動脈硬化狹窄性疾病的潛力，但目前并未在臨床上有所應用。在準分子激光應用于頸動脈粥樣斑塊減容前，需要在臨床前研究中對其可行性、減容效率以及安全性進行細致評估。本研究擬在體外實驗中探究準分子激光減容頸動脈粥樣斑塊的可行性及其效率。

準分子激光是一種脈沖式、紫外氣態激光。準分子激光減容粥樣硬化斑塊的機制包括光化學效應、光熱效應和光機械效應［6］。準分子激光通過打斷分子間的碳鍵從而瓦解、汽化斑塊中的有機成分；光熱作用與光機械作用的疊加，使得減容過程中產生的氣泡膨脹破裂，碎屑飛射，最終實現斑塊減容。理論上準分子激光產生的碎屑尺寸小于25μm，也有報道在準分子激光消融組織遺留深坑中觀察到1～10μm的碎屑［7］。通過對本實驗中捕獲的碎屑的直徑進行定量發現：準分子激光在體外減容頸動脈粥樣斑塊所產生的碎屑中，接近100%的最大卡鉗直徑為0～20μm，其中約95%的碎屑集中在0～5μm。有研究提示直徑為8～20μm的碎屑在造成顱腦微血管栓塞后可被轉移出血管腔從而實現血管再通［8］。這些碎屑造成的臨床結果不僅與直徑相關，還與同時向遠端腦血管中輸注的數量相關，需要謹慎推導，因此還須開展在體的動物實驗以明確其影響。我們還發現6F激光導管在減容頸動脈粥樣斑塊后產生的碎屑面積顯著大于8F激光導管所產生的碎屑面積。考慮原因可能為：8F激光導管擁有更大的尺寸，能夠容納更多的光纖，即在單位面積內能夠接收到更高的能量；實驗過程中8F激光導管推進的次數多于6F激光導管。以上兩點使得8F激光導管在減容頸動脈粥樣斑塊過程中能夠對頸動脈粥樣斑塊成分進行更充分的消融。與Ar+、CO2、YAG等熱激光采用熱效應發揮作用不同，準分子激光被認為是“冷激光”。由于準分子激光是脈沖式發射，同時兩次激光發射間隔遠大于激光發射持續時間，加之生理鹽水的輸注技術，使得準分子激光減容區域能充分降溫散熱并減少損傷［9-11］。因此，準分子激光被認為無熱損傷效應。既往通過準分子激光消蝕人離體主動脈及其斑塊，發現汽化主動脈及斑塊組織后遺留的汽化坑無熱損傷跡象。我們觀察到減容工作邊緣組織著色加深，未觀察到斑塊組織碳化的跡象，與既往研究結果［12-14］一致。為明確準分子激光減容頸動脈粥樣斑塊后管腔的微觀變化，我們利用掃描電鏡對減容后斑塊的管腔進行觀察，發現減容區域中血管內膜結構消失，同時內膜下的纖維成分暴露。

準分子激光減容通過去除頸動脈粥樣斑塊的組成，實現了管腔面積的顯著提升。這通過減容前后管腔面積、最大卡鉗直徑及最小卡鉗直徑的比較得以證實。既往研究中對主動脈或二尖瓣樣品大多沿縱軸切開或切分為小塊，隨后使用激光導管垂直于腔面/內膜面進行消融；或者將離體冠脈切分成約3 mm的短段后進行消融［15-16］。而本實驗中采用整體的頸動脈粥樣斑塊，并將激光導管置于腔內沿著縱軸方向進行減容，更符合臨床實際操作。此外，本實驗中評估減容效率所采用的定量方法有別于既往研究。既往研究中采用定量消蝕坑深度或減容前后樣品質量變化作為評估效率的指標［16-17］，我們采用減容前后管腔面積的變化為主要指標，同時還測量了管腔的最大及最小卡鉗直徑以輔助表征管腔的改變。殘余狹窄是介入治療術中一項重要的評價指標，我們對于管腔面積的定量更接近于臨床實踐。既往大多數的實驗并未對消蝕坑深度定量，Grundfest等［12］的研究給出了消蝕坑深度與激光發射頻率之間的線性數據。為實現不同定量數據之間的對比，我們對其數據進行了換算。25 Hz所對應的消蝕坑深度約為0.4 mm。理論上準分子激光的作用直徑比導管直徑大1/3，本實驗中6F激光導管（直徑2.0 mm）推進3次，故換算可得Grundfest等的研究中消蝕坑的面積約為3.2 mm2，略小于本實驗中6F激光導管對應的平均管腔增加面積4.86 mm2。在實驗中，我們發現6F激光導管雖然顯著增加了斑塊管腔面積，但是所增加的面積形態不規則。流體力學領域已經表明，管腔的局部狹窄可造成狹窄處血液流速增加、壁面剪切應力增加，隨著血小板、血管平滑肌細胞、內皮細胞以及巨噬細胞等對刺激及生物信號做出反應，改變表型、狀態與功能，可進一步加重狹窄，導致管腔閉塞或誘發遠端靶器官的不良事件［18-20］。解除局部狹窄可改善該狹窄處的血流動力學狀態［21］。6F激光導管減容頸動脈粥樣斑塊后可見楔形面積增加區域。這一楔形狹窄區域勢必會增加局部血流流變不穩定性。為均勻地增加管腔面積，同時實現較為理想的、穩定的血流流變狀態，我們換用了管徑更大的8F導管，同時增加了導管推進的次數。與圖1A相比，圖1C中顯示減容后的管腔更為規則。此外，換用了更大尺寸的激光導管在帶來更規則管腔的同時更顯著增加了管腔面積［（4.65±2.24）μm2vs.（6.71±1.58）μm2，P=0.0018，圖1J］。顯然，在斑塊或血管尺寸允許的情況下，8F的激光導管能夠獲得更優的結果。6F與8F激光導管之間依次應用是否能夠帶來相加或者相乘的效應，或者在帶來效率提升的同時是否伴隨著不良事件（如穿孔、夾層）的發生尚未可知，需要后續開展進一步實驗加以探討。

基于本研究的實驗結果以及國內外最新的研究進展，我們提出一個設想，即在特定的腦保護裝置下（如TCAR技術將血流通過過濾后回輸至靜脈系統［22］），通過準分子激光等新型技術手段對頸動脈粥樣斑塊進行有效減容，配合可降解血管支架的植入，可實現在血管腔內完全模擬CEA手術的效果，達到去除頸動脈粥樣斑塊、重建頸動脈的目的，實現EndoCEA（全腔內CEA）技術。

本研究的局限性在于使用的頸動脈粥樣斑塊樣品標本鈣化程度均較輕，根據激光器械產商的建議選擇了在下肢血管中的推薦參數。既往有研究提示，準分子激光需要在較高的能量下才能實現對于鈣化結節的汽化［23］。此外，本研究的頸動脈粥樣斑塊標本的病理類型尚不全面、樣本量相對較少。通過頸動脈內膜剝脫術獲得不同病理類型的頸動脈粥樣斑塊非人為可控，加之減容完成后的“事后分型”，要實現覆蓋所有病理類型，則需要擴大所使用的斑塊數量，這一過程中難免造成個別類型斑塊的“過量”，存在一定的“樣本浪費”。考慮到樣本的珍貴性及擴大樣本量這一措施的效益不可控性，我們并未采取擴大樣本量這一方式。未來的研究中需要實現在減容前對斑塊進行分型并納入鈣化性斑塊，同時需要尋找到一個適合消除頸動脈粥樣斑塊內鈣化性結節而不影響準分子激光安全使用的能量。此外，本研究使用的頸動脈粥樣斑塊處于離體狀態，已失去生物活性，無法觀察減容后斑塊表面是否形成血栓及斑塊內細胞對應的反應，故今后開展在體動物實驗非常必要。

綜上，準分子激光能夠顯著去除頸動脈粥樣斑塊組織，獲得斑塊管腔面積的增長。本體外實驗表明準分子激光具有臨床應用于解除頸動脈硬化狹窄的可行性，且減容效率較高。通過Micro CT以及臨床CTA影像實現了斑塊管腔面積比較，這一減容效率的刻畫更貼合臨床實踐。對碎屑產物的定量描述為下一階段的安全性研究提供了數據支持。在此基礎上結合國內外進展，我們創造性地提出了“Endo-CEA”這一新技術設想。未來尋找到合適的激光工作參數可以拓寬準分子激光能減容的頸動脈粥樣斑塊病理類型，更為重要的是開展臨床實踐之前需要進行相關在體動物實驗，以明確碎屑可產生的影響以及斑塊及血液成分對準分子激光減容的反應。

作者貢獻聲明楊凱 數據采集，統計分析，論文撰寫與修訂。譚晉韻 數據采集，統計分析，論文構思與修訂。鄧穎 數據采集，統計分析。史偉浩，余波 論文構思與修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。