細胞學檢查結合BRAF V600E基因檢測在TIRADS 4類甲狀腺結節定性診斷中的價值

張柳婷，陳松旺，趙燕妹

南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）超聲科，江蘇 南京 210000

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤之一，我國每1 000人中約90人發病，且發病率呈現城市地區高于農村地區、女性高于男性的分布特點［1］。韓國學者Kwak等［2］提出的甲狀腺影像報告和數據系統（Thyroid Imaging Reporting and Data System，TI-RADS）提示4類甲狀腺結節惡性概率為3.3%～72.4%，仍需甲狀腺結節活檢才可明確結節的性質。美國甲狀腺學會（American Thyroid Association，ATA）認為超聲引導下細針抽吸活組織檢查（ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy，US-FNAB）是診斷甲狀腺結節最準確、最經濟的方法［3］，現已成為鑒別甲狀腺結節性質和病理學類型的一線方法，但是其結果存在假陰性、穿刺不滿意的情況［4-6］，因此提高甲狀腺結節定性診斷的準確度還需要進一步的輔助診斷方法。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）是甲狀腺癌中最常見的組織學類型［7］，而PTC患者中BRAF V600E突變率可高達87.69%［8-9］。故本研究分析了2019年7月—2020年3月于南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）行US-FNAB及BRAF V600E基因檢測的178例TI-RADS 4類甲狀腺結節患者資料，旨在探討細胞學檢查結合BRAF V600E基因檢測在TI-RADS 4類甲狀腺結節定性診斷中的價值，為臨床制訂個體化治療方案提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2019年7月—2020年3月行US-FNAB、BRAF V600E基因檢測并且有手術后病理學檢查結果的TI-RADS 4類結節患者。TI-RADS 4類標準：根據可疑惡性超聲表現（實性成分、低回聲、極低回聲、微分葉或不規則邊緣、微鈣化和縱橫比＞1）劃分，具有1項可疑惡性超聲表現為TI-RADS 4a類，有2項可疑惡性超聲表現為TI-RADS 4b類，有3、4項可疑惡性超聲表現為TI-RADS 4c類。

納入標準：① 于南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）行常規超聲檢查，且TI-RADS分類為4類的甲狀腺結節（包括4a～4c）；② 于南京醫科大學附屬南京醫院（南京市第一醫院）行US-FNAB及BRAF V600E基因檢測；③ 有明確的術后組織病理學檢查結果。共178例患者納入研究，其中女性130例，男性48例，平均年齡（45.6±12.1）歲，平均結節直徑為（10.76±6.16）mm。

1.2 方法

1.2.1 US-FNAB標本采集

患者簽署知情同意書后，由副主任醫師以上的高年資醫師完成US-FNAB。采用意大利Esaote公司的MyLab 90彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭頻率為5～12 MHz，患者取仰臥位，先常規掃查甲狀腺，定位甲狀腺結節后消毒鋪巾，2%利多卡因溶液局部浸潤麻醉，然后在超聲引導下，將5 mL注射器的針頭推至結節中心并保持注射器的負壓狀態（圖1），反復提拉注射器后得到足夠的細胞，將其推至玻片上涂片，然后將玻片置于95%乙醇溶液中固定15 min，針筒內殘余細胞用液基細胞保存液沖洗保存，重復取樣過程3、4次，用于細胞病理學診斷。最后一次取樣后，將注射器內的標本注入裝有細胞保存液的Ependorf試管內保存，用于BRAFV600E基因檢測。

圖1 甲狀腺結節行US-FNAB術前及術中影像

1.2.2 US-FNAB標本細胞病理學判讀

由3、4名經驗豐富的病理科醫師共同完成判讀過程，根據Bethesda報告系統［10］將結果分為6類，Ⅰ類：標本無法診斷或不滿意，標本中＜6個濾泡細胞團，且每團細胞＜10個；Ⅱ類：良性病變；Ⅲ類：意義不明確的細胞非典型病變或意義不明確的濾泡性病變；Ⅳ類：濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類：可疑惡性腫瘤；Ⅵ類：惡性腫瘤。根據細胞學診斷的結果將結節分為兩組，A組由Bethesda Ⅱ類、Ⅴ類和Ⅵ類構成，為細胞學診斷確切組，B組由Bethesda Ⅰ類、Ⅲ類及Ⅳ類構成，為細胞學診斷模糊組。

1.2.3BRAFV600E檢測

使用德國Qiagen公司QIAamp DNA Micro Kit提取試劑盒抽提FNAB標本的DNA，采用廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司人類BRAFV600E ARMS-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書步驟操作，在實時PCR儀中打開設置窗口并設定循環條件：95 ℃ 5 min（1個循環）；95 ℃25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s（15個循環）；93 ℃25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s（31個循環）。在60 ℃時收集突變和內控信號，執行實時PCR，并保存文件。

1.3 統計學處理

應用SPSS 22.0軟件分析研究中的數據，以術后組織病理學檢查結果為標準，計算A組中細胞學檢查、BRAFV600E基因檢測及兩種檢測方法聯合后鑒別TI-RADS 4類甲狀腺結節的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值（positive predictive value，PPV）、陰性預測值（negative predictive value，NPV），應用χ2檢驗比較USFNAB與兩種檢測方法聯合的結果，P＜0.05為差異有統計學意義，并采用kappa檢驗，比較單獨細胞學檢查、基因檢測或二者結合后的結果與組織病理學檢查結果的一致性，若κ＜0為一致性弱；κ＜0.7一致性一般；0.7＜κ＜0.9一致性較好；κ＞0.9一致性極好。

2 結 果

2.1 組織病理學、BRAF V600E基因檢測和Bethesda細胞學分類結果

本研究行US-FNAB和BRAFV600E基因檢測的結節患者共178例，TI-RADS 4a、4b、4c類分別有32、89、57例，均行手術治療且有組織病理學檢查結果（表1）。惡性病變158例，占88.8%（158/178），包括157例PTC，1例甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）。良性病變20例，占11.2%（20/178），包括結節性甲狀腺腫12例，淋巴細胞性甲狀腺炎7例，濾泡型腫瘤1例。

表1 TI-RADS4類甲狀腺結節組織病理學情況

BRAFV600E突變型結節共126例，BRAFV600E野生型結節52例。細胞病理學檢查結果Bethesda Ⅰ類2例，Ⅱ類20例，Ⅲ類9例，Ⅳ類1例，Ⅴ類142例，Ⅵ類4例。178例結節的組織病理學結果、BRAFV600E基因檢測和Bethesda細胞學分類結果如表2所示。

表2 178例結節患者的Bethesda細胞學分類、BRAF V600E基因檢測和組織病理學結果

2.2 A組中BRAF V600E基因檢測、細胞學檢查及二者聯合的診斷效能比較

A組中的Bethesda Ⅱ類為良性結果，Bethesda Ⅴ類和Ⅵ類為惡性結果，以術后病理學檢查結果為標準，故US-FNAB鑒別結節良惡性的靈敏度、特異度及準確度分別為97.3%、88.9%及96.4%，細胞病理學檢查與組織病理學檢查結果一致性較好（κ=0.822±0.071）。BRAFV600E基因檢測鑒別結節良惡性的靈敏度、特異度及準確度分別為80.4%、100.0%及82.5%，一致性方面，BRAFV600E檢測結果與組織病理學結果一致性一般（κ=0.471±0.076）。

細胞學檢查、BRAFV600E突變基因檢測兩種檢查方法聯合預測結節良惡性的靈敏度、特異度及準確度為99.3%、88.9%及98.2%，一致性檢驗中，細胞學檢查與基因檢測結合后與組織病理學檢查結果一致性極好（κ=0.904±0.055，表3）。比較兩種檢測方法聯合后與US-FNAB的診斷準確程度，χ2=74.5，P＜0.05，二者之間差異有統計學意義。

表3 3種方法的診斷效能比較

2.3 B組中BRAF V600E基因檢測的診斷價值

如表2所示，B組共12例結節，共有7例發生BRAFV600E突變，均被術后組織病理學檢查結果證實為PTC。其中Bethesda Ⅰ類結節中有1例存在BRAFV600E突變，9例Bethesda Ⅲ類結節中，表現為BRAFV600E突變型的共6例，Bethesda Ⅳ類結節中未發現BRAFV600E突變。

3 討 論

US-FNAB是術前對甲狀腺結節定性診斷的常用手段，而目前在行US-FNAB時增加分子標志物檢測以提高其準確度受到廣泛關注［11］，甲狀腺癌內較常見的突變類型有BRAF突變、RAS突變、RET/PTC重排、Pax8-PPARγ融合基因等［12］。B R A F基因位于人類7號染色體（7q34），其編碼的蛋白質本質上為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，同時也是激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的關鍵分子［13-14］。BRAF基因已鑒定出的40多種突變中的T1799A型占所有突變的90%以上［15］，該突變為BRAF基因第15個外顯子上第1 799位發生點突變，導致其編碼的蛋白質第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）取代，所以也被稱為BRAFV600E突變。BRAF突變使得MAPK通路被持續激活，細胞不斷增殖形成腫瘤［16］。有學者［17］認為，BRAF突變在甲狀腺癌的進展過程中起著關鍵作用，同時BRAFV600E在甲狀腺癌中突變頻率較高，且與高危臨床病理特征、不良預后相關［18-21］，而且BRAFV600E檢測的靈敏度和特異度也較高［22］，故本研究選擇該位點。

納入本研究的178例結節患者中共126例檢測到BRAFV600E突變，術后組織病理學檢查結果證實均為PTC，52例未發生BRAFV600E突變，有20例為甲狀腺良性病變，BRAFV600E基因檢測的特異度高達100.0%，準確度為82.5%，靈敏度為80.4%，但是與組織病理學檢查結果的一致性一般，所以BRAF V600E檢測結果并不能很好地反映組織病理學檢查結果，而且由于BRAF V600E只存在于PTC和部分起源于PTC的間變性甲狀腺癌［23］，故基因檢測的陰性結果并不能排除其他類型甲狀腺腫瘤的可能，也就無法單獨使用其對TI-RADS 4類甲狀腺結節進行術前定性診斷。

本研究根據細胞病理學檢查結果將結節分為兩組，A組（診斷確切）和B組（診斷模糊），以明確BRAF V600E基因檢測的診斷價值。A組中有20例Bethesda Ⅱ類結節中出現4例假陰性，而其中有3例發生BRAF V600E突變。因BRAF V600E突變特異度較高，若術前參照基因檢測結果，便可知該3例結節為惡性腫瘤可能性大，由此可知，US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測可在一定程度上避免假陰性結果。A組內146例Bethesda Ⅴ類結節中有2例為結節性甲狀腺腫伴部分濾泡上皮呈乳頭狀改變，為細胞學診斷出現假陽性，基因檢測結果均未見突變。正如前文所述，BRAF V600E突變僅存在于PTC中，故BRAF V600E基因檢測的陰性結果并不能排除惡性腫瘤，所以其并不能避免假陽性的出現。

A組中的結節如將BRAF V600E基因檢測應用于US-FNAB中，鑒別結節良惡性的準確度和靈敏度可達98.2%和99.3%，均比單獨行USFNAB的96.4%和97.3%有所提升，這與部分文獻［24-25］報道接近。在一致性檢驗中，BRAF V600E聯合US-FNAB的κ值為0.904±0.055，而單獨行US-FNAB的κ值為0.822±0.071，前者與組織病理學診斷的一致性極好，后者一致性較好。雖然US-FNAB的κ值小于兩種檢測方法聯合，但是其診斷準確度與靈敏度均差于兩種檢測方法聯合。綜上，在細胞學診斷確切的結節中BRAF V600E基因檢測聯合US-FNAB既能及時彌補假陰性的情況，又能提高診斷準確度，繼而提高術前定性診斷的效率。

而在B組（診斷模糊）中，共有10例患者的結節被組織病理學結果證實為PTC，分別為Bethesda Ⅰ類1例（50.0%），Ⅲ類9例（100.0%），其余2例均為良性病變。盡管細胞學診斷無法給予準確的結果，但是Bethesda Ⅰ類、Ⅲ類結節仍有5%～10%、6%～18%的概率為惡性腫瘤［26］，可是若依靠基因檢測的陽性結果，比如此次研究中B組最終診斷為PTC的結節中7例發生BRAF V600E突變，臨床便可推測結節為惡性腫瘤可能性大，及時給予手術治療避免重復行US-FNAB對患者造成經濟及心理壓力。故基因檢測具有一定的補充作用，可通過US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測提高惡性結節的檢出率，提高術前定性診斷的準確度，這與相關文獻［27］的結論一致。

本研究為回顧性研究，根據術后組織病理學檢查結果收集結節信息，部分US-FNAB結果顯示為良性（Bethesda Ⅱ類）的結節選擇隨訪觀察時，即使基因檢測結果為BRAF V600E突變，也會因為缺乏術后組織病理學檢查結果而被排除在研究范圍外，造成一定程度的偏倚。由此可見，在TI-RADS 4類甲狀腺結節行US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測后診斷效率有所提升，無論細胞學診斷確切與否BRAF V600E基因檢測都能夠篩查出部分惡性結節，提高定性診斷的準確度。所以在TI-RADS 4類甲狀腺結節中，細胞學檢查結合BRAF V600E基因檢測，能夠提高定性診斷的效率，減少手術治療延誤的可能，而且避免重復行US-FNAB或者密切隨訪帶來的經濟及心理壓力，具有在臨床中廣泛應用的價值。