二母散對博來霉素誘導大鼠肺纖維化模型FGF、CTGF和Collagen Ⅰ表達的影響*

李 想 劉 暢

(中國醫科大學腫瘤醫院 遼寧省腫瘤醫院，沈陽 110042)

二母散來源于《景岳全書》卷五十七，川貝母6 g(去芯)，知母6 g，上藥水煎服，貝母化痰瀉肺火，知母滋腎清肺金，潤能去燥，苦能泄熱，主治肺熱咳嗽，喘急咳嗽[1]。中醫把肺纖維化歸為肺痿、肺痹，主要涉及肺、脾、腎三臟，常因病情日久，出現虛實夾雜，主要是氣虛、陰虛、陽虛或者肺腎陰虛。所以在肺纖維化的治療中，常常采用補虛、扶正的方法。肺纖維化也分為急性期和緩解期，在緩解期時會采用補肺、補腎的方法，二母散的功效為滋陰清肺，止咳化痰，與肺纖維化的干咳、乏力、呼吸困難等常見癥狀相適應。研究表明化痰類中藥川貝母對肺纖維化有明顯的干預作用，川貝母可從氧化應激、炎癥反應、血管新生等多途徑對大鼠肺纖維化模型產生影響。湖北省中醫院楊毅教授常用二母散治療感染后咳嗽、慢性咳嗽、支氣管哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等急慢性呼吸道疾病常獲良效[2]。渠樂等[3]研究表明二母散對穩定期肺陰虧虛型老年COPD患者臨床療效顯著,可顯著降低炎癥指標水平，改善患者肺功能，緩解臨床癥狀。北京中醫藥大學東直門醫院姜良鐸教授治療肺間質纖維的常以具有扶正以補益肺、脾、腎氣陰虛的紫河車、赤芍、白芍、知母、貝母等藥物為主[4]。本研究以二母散為研究對象，探索其對博來霉素誘導肺纖維化模型的影響，為肺纖維化的防治及其中藥新藥的研制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥物

川貝母粉，購自江陰天江藥業有限公司(批號：19071351，每袋1 g)；知母配方顆粒，購自江陰天江藥業有限公司(批號：19102311，每袋2.5 g相當于10 g生藥)；鹽酸潑尼松片，購自遂成藥業股份有限公司(批號1812132，5 mg/片，60 mg/d)。

1.2 實驗動物及飼養環境

SPF級SD大鼠50只，雄性，體質量180～220 g，購自遼寧長生生物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001。中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2017-0004。相對濕度55%～60%，溫度22～25 ℃，晝夜交替12 h/12 h。實驗期間大鼠自由攝食及飲水。

1.3 儀器設備及試劑

烤片機和攤片機，購自陽光神琦醫用科技有限公司；BX53型奧林巴斯光電顯微鏡；電熱恒溫培養箱，購自廈門醫療電子儀器廠；TP1020型自動徠卡脫水機；德國徠卡切片機；賽默飛世爾全自動免疫組化染色機；無水乙醇，購自沈陽市新化試劑廠(批號：20190711)；PBS磷酸鹽緩沖鹽，購自北京Solarbio科技有限公司(批號：20190215)；多聚甲醛(批號：20190428)和乙醚(批號：10009318)，購自國藥集團化學試劑有限公司；Ⅰ型膠原蛋白抗體試劑盒(Anti-Collagen Ⅰ antibody，批號：09030578R)、成纖維細胞生長因子抗體試劑盒(Anti-FGF antibody，批號：09022123483R)和結締組織生長因子抗體試劑盒(Anti-CTGF antibody，批號：09040743R)，購自北京博奧森生物技術有限公司；枸櫞酸緩沖鹽(批號：19012613)、TMS-P超敏試劑盒(批號：190425382l)和DAB顯色試劑盒(批號：1904240412B)，購自福建邁新生物技術開發有限公司。

1.4 方法

1.4.1動物造模及給藥：50只SD大鼠，按體質量隨機分為假手術組(SC組)、模型對照組(M組)、二母散低劑量組(1.08 g生藥/kg，EL組)、二母散高劑量組(2.16 g生藥/kg，EH組)(注：二母散的每日擬用量為12 g生藥，根據人與大鼠用藥量轉換方法：200 g大鼠的每日用藥量=人用量×0.018。即大鼠給藥量為12 g生藥×0.018/200 g×1 000 g=1.08 g生藥/kg；高劑量組給藥量為為低劑量給藥組的2倍即1.08 g生藥/kg×2=2.16 g生藥/kg)、潑尼松對照組(5.4 mg/kg，PR組)，每組10只。大鼠適應飼養一周后，乙醚麻醉，切開頸部皮膚，暴露氣管，經氣管內滴注博萊霉素溶液0.2 mL(50 mg/mL)[5]，為了使博萊霉素溶液能夠在肺內均勻分布，滴注后立即將大鼠直立并左右搖晃20 s[6]。假手術組滴入等體積的生理鹽水。造模3 d后開始灌胃給藥，給藥劑量為10 mL/kg，假手術組和模型對照組灌胃等體積的蒸餾水， 1次/d，連續給藥4周。實驗結束大鼠禁食不禁水12 h，稱體質量，乙醚麻醉，取肺臟稱質量，計算肺臟指數(肺臟指數=肺質量/體質量×100%)[7]，取右肺中葉，多聚甲醛溶液固定，用于HE染色和免疫組化染色。

1.4.2HE染色方法：將肺組織從固定液中取出脫水，石蠟包埋，制作5 μm石蠟切片，常規HE染色。光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理改變。根據Szapiel標準對肺泡炎癥及肺纖維化進行病理分級評價[8]：1級，無炎癥，0分；2級，輕度炎性細胞浸潤和纖維化，范圍小于20%，1分；3級，中度肺炎和纖維化，肺泡間隔增厚，20%～50%，2分；4級，重度肺炎和纖維化，病變范圍大于50%，3分。

1.4.3免疫組化染色方法：石蠟切片于60 ℃烘烤4 h，常規梯度脫蠟至水，PBS漂洗15 min，3% H2O2孵育10 min，PBS漂洗15 min，將切片置于pH 7.0的枸櫞酸緩沖液中高壓修復5 min。5%的BSA室溫下孵育15 min，PBS稀釋的一抗(FGF 1∶200，CTGF 1∶150，Collagen Ⅰ 1∶250)，于37 ℃孵育2 h。PBS漂洗15 min。滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗15 min。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗15 min。滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，中性樹膠封片，圖片采用ImageJ軟件進行半定量分析，檢測灰度值。將白色與黑色之間按對數關系分成若干級，灰度值范圍從0～255，白色為255，黑色為0，因此抗體表達越強，組織染色越深，灰度值越小[9]。然后采用灰度值計算光密度值(optical density，OD)，OD=log(背景區灰度值/抗體陽性反應區灰度值)。

2 結果

2.1 二母散對大鼠肺纖維化模型肺臟指數的影響

結果見表1所列。與SC組相比，M組大鼠肺臟指數顯著增加(P<0.01)；與M組相比，EL組、EH組、PR組肺臟指數顯著降低(P<0.01)。

表1 各組大鼠肺臟指數的比較Table 1 Comparison of lung index of rats in each group

2.2 二母散對大鼠肺纖維化模型肺組織HE染色病理分級的影響

結果見圖1、表2。與SC組相比，M組HE染色病理分級顯著增加(P<0.01)；與M組相比，EL組HE染色病理分級明顯降低(P<0.05)，EH組、PR組HE染色病理分級顯著降低(P<0.01)。

表2 各組肺組織HE染色病理分級的比較Table 2 Comparison of HE staining pathologicalgrading of lung in each group

圖1 各組肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissue in each group (× 200)

2.3 二母散對大鼠肺纖維化模型肺組織FGF、CTGF和Collagen Ⅰ表達的影響

結果見表3及圖2～圖4。與SC組相比，M組肺組織細胞FGF表達顯著增加(P<0.01)；與M組相比；EL組、EH組肺組織細胞FGF表達未見顯著性差異(P>0.05)，PR組顯著降低(P<0.05)。與SC組相比，M組肺組織細胞CTGF表達顯著增加(P<0.01)；與M組相比，EL組、EH組、PR組肺組織細胞CTGF表達顯著降低(P<0.01)。與SC組相比，M組肺組織細胞Collagen Ⅰ 表達顯著增加(P<0.01)；與M組相比，EL組、EH組肺組織細胞Collagen Ⅰ 表達明顯降低(P<0.05)，PR組顯著降低(P<0.01)。

表3 各組免疫組化染色肺組織細胞FGF、CTGF和Collagen Ⅰ表達的比較Table 3 Comparison of the expressions of FGF, CTGF and Collagen Ⅰ in immunohistochemical staining in lung of each group

圖2 二母散對大鼠肺纖維化模型肺組織FGF表達的影響(×200)Fig.2 The effect of Ermu Powder on the expression of FGF in lung (× 200)

圖3 二母散對大鼠肺纖維化模型肺組織CTGF表達的影響(×200)Fig.3 The effect of Ermu Powder on the expression of CTGF in lung (×200)

圖4 二母散對大鼠肺纖維化模型肺組織免疫組化染色Collagen Ⅰ表達的影響(×200)Fig.4 The effect of Ermu Powder on the expression of Collagen Ⅰ in lung (×200)

2.4 EL組、EH組大鼠肺臟指數、FGF、CTGF及Collagen Ⅰ表達相關性分析

Pearson相關分析顯示EL組和EH組大鼠肺臟指數與FGF表達之間不具有相關性(P>0.05)；EL組和EH組大鼠肺臟指數與CTGF及Collagen Ⅰ表達之間具有相關性，呈正相關(P<0.05)；EL組和EH組大鼠肺組織FGF表達與CTGF及Collagen Ⅰ表達之間不具有相關性(P>0.05)；EL組和EH組大鼠肺組織CTGF表達與Collagen Ⅰ表達之間具有相關性，呈正相關(P<0.05)，見表4～表6所列。

表4 EL組、EH組大鼠肺臟指數與FGF、CTGF和Collagen Ⅰ表達相關性分析Table 4 Correlation analysis of lung index and expressionof FGF, CTGF and Collagen Ⅰ in EL group and EH group

表5 EL組和EH組大鼠肺組織FGF表達與CTGF和Collagen Ⅰ表達相關性分析Table 5 Correlation analysis of the expression ofFGF and CTGF and Collagen Ⅰ in the lung tissuesof rats in EL and EH groups

表6 EL組和EH組大鼠肺組織CTGF表達與Collagen Ⅰ表達相關性分析Table 6 Correlation analysis of CTGF expression andCollagen Ⅰ expression in lung tissue of ELgroup and EH group

3 討論

川貝母有清熱潤肺、化痰止咳以及散結消腫的功效，可用于肺虛久咳、燥熱咳嗽等癥狀的治療[10]，現代藥理研究表明貝母可降低博萊霉素致肺纖維化大鼠的MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化水平[11]，提高肺纖維化大鼠模型SOD、MDA及GSH的含量可能是其抗纖維化的作用機理。知母清熱瀉火、生津潤燥。二母散由川貝母和知母組方而成，貝母和知母為治療肺間質纖維化的臨床常用藥物[12]。

肺纖維化進程分為三個階段，急性損傷階段、炎癥反應階段和自我修復階段[13]，早期呈現急性肺損傷，肺泡內液體與血漿蛋白漏出，隨時間推移肺內膠原蛋白引起肺組織纖維化[14]。本研究中治療4周后與SC組相比，M組大鼠肺臟指數顯著增加、病理分級顯著增加；與M組相比，EL組、EH組肺臟指數顯著降低、病理分級顯著降低，根據肺臟指數與病理分級相關性分析結果可以得出炎癥及纖維化反應越強肺臟指數越大，說明二母散可能通過減少肺泡內液體與血漿蛋白滲出，降低炎癥及纖維化反應級別，進而產生降低肺臟指數的作用。

機體器官是由間質和實質兩部分構成，間質主要起連接和機械支撐作用，由間質細胞和細胞外基質構成。細胞外基質還參與多種生理病理過程，在組織創傷后修復和纖維化過程中起重要的作用[15]。如果組織損傷較大超出了損傷實質細胞的再生能力時，間質纖維結締組織將會大量增生進而對缺損組織進行修復，即發生纖維化的病理改變，引起器官的纖維化[16]。多種器官均可發生纖維化，其病理改變為實質細胞減少，并伴有組織內纖維結締組織增多，可導致器官因結構破壞而功能減退。肺泡組織被炎癥損傷后，其恢復為正常的肺組織還是產生纖維化取決于壞死的組織碎片能否被完全吸收[17]，如果壞死的組織碎片不能被完全吸收就會被纖維組織取代。成纖維細胞是功能活動旺盛的細胞，具明顯的蛋白質合成和分泌活動，在炎癥損傷等刺激下，部分纖維細胞可重新轉變為成纖維細胞，參與組織損傷后的修復[18]。FGF是參與肺纖維化的重要細胞因子具有廣泛生物活性[19]，FGF可以由巨噬細胞、內皮細胞分泌，它的作用是促進內皮細胞的游走，促進新血管形成，FGF被認為是病灶形成促進因子，FGF可增強TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖，促進成纖維細胞增生和膠原纖維合成，促進肺組織的纖維化[20]。CTGF對成纖維細胞具有趨化及促有絲分裂作用，CTGF還具有促細胞增殖及分化等作用[21]，CTGF與包括肺、肝、心臟、腎臟、胰腺等在內的許多組織器官纖維化發生發展密切相關[22]。肺組織在炎癥損傷等刺激下，肺間質成纖維細胞被激活，轉換為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞可分泌細胞外基質，產生Collagen Ⅰ，促使Collagen Ⅰ合成增多，而Collagen Ⅰ是構成肺組織纖維的主要成分[23]，Collagen Ⅰ是主要的細胞外基質，Collagen Ⅰ的過度沉積可導致不可逆肺纖維化進程，因此抑制Collagen Ⅰ合成，可有效降低肺纖維化的形成[24]。本研究表明與SC組相比，M組肺組織FGF、CTGF和Collagen Ⅰ表達顯著增加；與M組相比，EL組、EH組FGF表達未見顯著性差異，二母散組肺組織細胞CTGF和Collagen Ⅰ表達顯著降低。說明二母散可能通過抑制CTGF和Collagen Ⅰ在模型肺組織的表達而產生抑制博來霉素誘導大鼠肺纖維化形成的作用，而與FGF表達無關。

綜上所述，二母散可能通過抑制CTGF和Collagen Ⅰ在肺組織的表達，進而降低肺纖維化模型肺組織炎癥及纖維化病理級別，最終產生抑制博來霉素誘導大鼠肺纖維化形成的作用。