干擾長鏈非編碼RNA NEAT1上調miR-126抑制胃癌細胞的生長、間質轉換及裸鼠腫瘤形成*

陶正貴 杜靜虎 田 葵 王東華 胡鳳琪 陳 鈺

(1. 湖北文理學院附屬醫院，襄陽市中心醫院普外科，襄陽 441000)(2. 襄陽市中心醫院腎內科，襄陽 441000)

核富集的轉錄物1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)是近年來研究新發現的一個長鏈非編碼RNA，作為細胞核內paraspeckles的重要組成，主要用于維持細胞核內mRNA的穩定、調節基因的表達[1]。臨床研究發現，NEAT1在腫瘤的發生發展過程中，都存在異常高表達現象，并且與腫瘤的轉移、分期、預后等密切相關[2-3]。miRNA是廣泛存在真核生物中具有保守性的一類特異性的核苷酸[4]，可參與細胞的多種生物學行為，如細胞的增殖、分化、凋亡等[5-7]。miR126是一種高表達于內皮細胞、漿細胞樣樹突狀細胞中的短鏈核苷酸[8]，研究顯示其在腫瘤細胞中表達水平顯著降低；恢復腫瘤細胞miR126的表達水平后，腫瘤增殖明顯受到抑制[9]。目前，關于長鏈非編碼RNA NEAT1與miR-126的靶向關系及對腫瘤的生物學行為研究尚無報道。因此，本研究主要探討長鏈非編碼RNA NEAT1與miR-126的靶向關系及對胃癌細胞的生物學行為影響，并通過構建移植瘤裸鼠模型，分析NEAT1對腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胃癌細胞MGC-803、SGC-7901和人胃上皮細胞購自ATCC；SPF級BALB/c雌性裸鼠20只，4～6周齡，體質量17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2017-0022。DMEM培養液及胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司)；胎牛血清(Gibco)；LipofecamineTM2000 TRIzol反轉錄試劑盒(Thermo Fisher)；SYBR PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO)；Ki67、Caspase-3、N-cadherin、E-cadherin、β-actin、蛋白抑制劑等(Santa Cruz)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo)；Ki67、Caspase-3成套免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；NEAT1陰性對照病毒、NEAT1干擾shRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；細胞裂解液、ECL化學發光試劑、MTT試劑及其他試劑、耗材(北京索萊寶科技有限公司)。

CO2培養箱(SanYo)；DNM-9606酶標分析儀(北京朗普新技術有限公司)；濕轉儀(AB)；凝膠成像系統(DNR)；PCR儀(Thermo)；XD-202倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)；FACSCalibur流式細胞儀(BD)；電泳儀、圖像采集及圖像分析系統(Bio-Rad)；其他儀器購自Eppendorf。

引物序列：①NEAT1引物。F:5′-GGCAGGTCTAG TTTGGGCAT-3′，R:5′-CCTCATCCC TCCCAGTACCA-3′；②β-actin引物。F:5′-CCTCG CCTTT GCCGA TCC-3′，R:5′-GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC -3′；③miR-126引物。F:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；R:5′-GCCGCTCGTA CCGTGAGTAATAATG-3′。

1.2 方法

1.2.1細胞培養:用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEN高糖培養基培養胃癌細胞MGC-803、SGC-7901和人胃上皮細胞GES-1，培養條件為37 ℃、5% CO2恒溫恒濕。隔天換液1次，細胞融合度達到75%以上，3次傳代后進行檢測。

1.2.2慢病毒轉染：取對數生長期的MGC-803和SGC-7901，調整細胞濃度為1×105個/mL，2 mL/孔，接種6孔板，繼續培養，待細胞生長覆蓋度達到50%按照試劑操作說明書要求進行慢病毒轉染。陰性對照組(shRNA-NC)加入20 μL NEAT1陰性對照病毒(NEAT1-NC，滴度2×108TU/mL)，實驗組(sh-NEAT1)加入6 μL NEAT1干擾病毒(NEAT1-shRNA，滴度9×108TU/mL)及2 μL polybrene(5 μg/μL)，對照組(control)加入20 μL培養基，轉染過夜后(約16 h)，每天更換新鮮培養基。培養5 d后，加入終濃度為 2 μg/mL嘌呤霉素篩選耐藥細胞株，Western blot鑒定病毒轉染效果，將轉染成功的細胞用于后續實驗。

1.2.3細胞增殖：根據EDU染色試劑盒說明書，檢測細胞增殖。完全培養基稀釋EDU溶液，作用濃度為10 μmol/L， 100 μL/孔，孵育2 h后棄培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，Apollo染色，立即檢測或用抗熒光淬滅封片后，保存檢測。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡：取對數生長期細胞，調整細胞濃度為2.5×105個/mL，2 mL接種于6孔板，過夜培養(約16 h)。次日更換無血清培養基，誘導培養處理24 h。離心收集細胞于上樣管，按照Annexin V-FITC試劑盒說明書向每管中依次加入150 μL AnnexinV-FITC結合液，3 μL AnnexinV-FITC和2 μL PI染液重懸細胞，室溫暗室孵育15 min。加PBS至500 μL混勻過300目篩，30 min內上機檢測，Cell Quest軟件檢測分析細胞凋亡情況。

1.2.5細胞侵襲實驗：Transwell小室中將5 μg 纖黏連蛋白用移液器均勻涂抹在小室內的PVPF聚碳酸濾膜外表面；膜內側表面涂5 μg基底膠。調整細胞量每室接種2×105個細胞，設置3個重復孔；培養4 h后PBS清洗3次并去除小室中膜內側表面多余的細胞，4%多聚甲醛進行固定；隨機選取10個視野, 倒置顯微鏡下采用雙盲計數法統計膜下表面的細胞數目平均值。實驗重復檢測3次。

1.2.6劃痕遷移實驗：將劃痕實驗插件置于24孔板，取對數生長期的目的細胞，調整細胞量為5×105個，過夜培養(約16 h)。小心移去劃痕實驗插件，用完全培養基潤洗3次，加入10 μmol/L絲裂霉素，繼續培養2 h，更換新鮮完全培養基，顯微鏡下拍照，時間點為0 h，繼續培養24 h拍照分析細胞的遷移情況。

1.2.7RT-PCR：依據TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度及純度，按照cDNA反轉錄試劑盒說明書，配置反轉錄PCR體系，設置PCR擴增程序進行反轉錄擴增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對miR-126表達水平進行檢測，內參基因選擇β-actin管家基因，引物的合成由Thermo Fisher完成。

1.2.8熒光素酶報告實驗：用RT-PCR擴增miR-126片段，純化后以pMIR-REPORT為基因載體，構建miR-126野生質粒，采用基因突變技術構建miR-126突變質粒，LipofecamineTM2000分別或同時對TPC-1細胞進行轉染，各組熒光素酶活性依據Dual Luciferase報告基因試劑盒進行分析。

1.2.9蛋白表達檢測：將目標細胞或組織裂解液冰浴裂解30 min取上清液提取總蛋白，酶標儀490 nm波長蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，4 ℃條件依次加入封閉液孵育2 h，一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶1 000)，二抗孵育2 h(稀釋比例均為1∶5 000)。用ECL化學發光試劑顯色，在凝膠成像系統檢測分析蛋白條帶，蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，內參采用β-actin。

1.2.10移植瘤裸鼠模型構建及處理：20只SPF級BALB/c 裸鼠隨機分為2組，10只/組，對照組每只裸鼠左側腋窩外側皮下注射0.2 mL SGC-7901細胞培養液，模型組注射0.2 mL轉染sh-RNA的SGC-7901細胞培養液，細胞接種量均為5×106個/只，SPF級飼養環境中分籠飼養，注射1周后記錄每只裸鼠的成瘤情況，剔除移植瘤失敗或30 d內死亡裸鼠，使用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑和最小直徑，腫瘤體積=(最大直徑×最小直徑)2/2。30 d后，將裸鼠處死，體內完整的取下瘤組織精確稱量瘤的質量。

1.2.11免疫組化分析：取各組裸鼠腫瘤組織樣本，經4%多聚甲醛固定后，做成組織切片，按照試劑盒說明書操作進行Ki67和Caspase-3免疫組化染色，顯微鏡下觀察組織中蛋白表達。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 NEAT1在胃癌細胞中表達分析

通過胃癌細胞和正常的胃上皮細胞NEAT1 mRNA表達分析結果顯示，NEAT1在胃癌細胞SGC-7901和MGC-803中的表達水平顯著高于正常胃上皮細胞GES-1，差異有統計學意義(P<0.05)。慢病毒轉染sh-NEAT1敲除腫瘤細胞中NEAT1，Western blot分析顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞中NEAT1表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞中NEAT1表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 NEAT1在胃癌細胞中表達分析注：與對照組相比，*P<0.05Fig.1 Analysis of NEAT1 expressionin gastric cancer cellsNote：Compared with control group，*P<0.05

2.2 NEAT1沉默對胃癌細胞增殖的影響

通過BrdU分析NEAT1沉默對胃癌細胞增殖的影響結果顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞增殖水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞的增殖水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2A。通過Western blot對各組細胞Ki67蛋白表達分析顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞中Ki67表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞中Ki67表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。流式細胞術分析NEAT1沉默后細胞凋亡情況結果顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞的凋亡比例顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞凋亡情況差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2C。Western blot結果顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞中Caspase-3表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞中Caspase-3表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2D。

圖2 NEAT1沉默對胃癌細胞增殖的影響注：與對照組相比較，*P<0.05Fig.2 Effect of NEAT1 silencing on proliferation of gastric cancer cellsNote：Compared with control group，*P<0.05

2.3 NEAT1沉默對胃癌細胞侵襲及遷移能力的影響

通過Transwell小室和劃痕實驗分析NEAT1沉默對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響結果顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803的浸潤細胞比例顯著減少，劃痕細胞覆蓋率明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞的浸潤比例和劃痕覆蓋率差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3A、圖3B。Western blot分析顯示，與對照組相比，sh-NEAT1組SGC-7901和MGC-803細胞中E-cadherin表達水平顯著升高，N-cadherin表達水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，而shRNA-NC組細胞中E-cadherin和N-cadherin表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3C。

圖3 NEAT1沉默對胃癌細胞侵襲及遷移能力的影響注：與對照組相比，*P<0.05Fig.3 Effect of NEAT1 silencing on invasion and migration of gastric cancer cellsNote: Compared with control group，*P<0.05

2.4 NEAT1靶向miR-126關系分析

靶向基因在線軟件分析發現，miR-126序列中存在NEAT1的結合位點(圖4A)。分析各組細胞miR-126的表達水平結果顯示，miR-126在胃癌細胞SGC-7901和MGC-803中的表達水平明顯低于正常胃上皮細胞GES-1，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4B。NEAT1基因沉默后，胃癌細胞SGC-7901和MGC-803的miR-126表達水平顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4C，表明NEAT1能夠抑制miR-126表達。靶向調控關系的熒光素酶結果(圖4D)顯示，miR-126作用后NEAT1野生質粒的熒光素酶活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而NEAT1突變質粒的熒光素酶活性無明顯影響，這表明NEAT1和miR-126之間存在靶向調控關系。

圖4 NEAT1靶向miR-126關系分析Fig.4 Analysis of relationship of NEAT1 targeting miR-126

2.5 NEAT1/miR-126對生長和運動的調節

BrdU增殖結果顯示，沉默NEAT1后，SGC-7901細胞的增殖明顯受到抑制(P<0.05)，miR-126抑制劑能促進SGC-7901細胞的增殖，并顯著減弱sh-NEAT1對SGC-7901細胞的增殖抑制作用(P<0.05，圖5A)。流式細胞術結果顯示，沉默NEAT1后，SGC-7901細胞的凋亡比例顯著增加(P<0.05)，miR-126抑制劑能促進SGC-7901的細胞凋亡，并顯著抑制sh-NEAT1對SGC-7901細胞的凋亡誘導作用(P<0.05，圖5B)。Transwell小室和劃痕實驗結果顯示，沉默NEAT1后，SGC-7901細胞的侵襲、遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，miR-126抑制劑能促進SGC-7901細胞的侵襲、遷移，并顯著減弱sh-NEAT1對SGC-7901細胞侵襲、遷移能力的抑制作用(P<0.05)，見圖5C、圖5D。

圖5 NEAT1/miR-126對生長和運動的調節注：與對照組相比,*P<0.05；與sh-NEAT1組相比，#P<0.05Fig.5 Regulation of growth and movement by NEAT1/miR-126Note：Compared with control group，*P<0.05；Compared with sh-NEAT1 group，#P<0.05

2.6 NEAT1對裸鼠體內腫瘤的影響

裸鼠體內抗腫瘤結果顯示，NEAT1基因沉默后，與對照組相比，sh-NEAT1組裸鼠腫瘤的體積增大速度明顯低于對照組(P<0.05，圖6A)，但sh-NEAT1組裸鼠腫瘤質量顯著高于對照組(P<0.05，圖6B)。分析腫瘤組織中蛋白表達水平結果顯示，NEAT1基因沉默后，與對照組相比，sh-NEAT1組裸鼠腫瘤細胞中NEAT1的表達水平顯著降低，miR-126的表達水平顯著升高(P<0.05，圖6C)。免疫組化結果顯示，NEAT1基因沉默后，與對照組相比，sh-NEAT1組裸鼠腫瘤組織中Ki67的表達量顯著降低，Caspase-3的表達量顯著增加(P<0.05，圖6D)；Western blot結果顯示，NEAT1基因沉默后，與對照組相比，sh-NEAT1組裸鼠腫瘤組織中N-cadherin的表達量顯著降低，E-cadherin的表達量顯著增加(P<0.05，圖6E、圖6F)。

圖6 NEAT1對體內腫瘤的影響注：與對照組相比,*P<0.05Fig.6 Effects of NEAT1 on tumors in vivoNote: Compared with control group,*P<0.05

3 討論

長鏈非編碼RNA多是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而來，其長度約200 bp。研究顯示，多數的長鏈非編碼RNA為原癌基因，雖然不具有蛋白質翻譯功能，卻通過參與其他基因的表達調控，影響細胞的增殖、侵襲和轉移[10-12]。NEAT1是由人11號染色體上的多發性內分泌瘤病基因位點的RNA聚合酶Ⅱ轉錄而成，它能夠與多個靶基因相結合，調控靶基因的表觀遺傳譜，從而促進癌基因的表達，促進腫瘤的生長和轉移[13]。miR-126在機體內主要發揮抑腫瘤作用。

本研究結果顯示，NEAT1在胃癌細胞SGC-7901和MGC-803中的相對表達水平顯著高于正常胃上皮細胞GES-1，與Choudhry等[14]在乳腺癌中的研究結果一致。通過病毒轉染sh-NEAT1對干擾腫瘤細胞NEAT1表達后發現，SGC-7901和MGC-803細胞中NEAT1相對表達水平顯著下降，而轉染shRNA-NC組細胞中NEAT1相對表達水平無明顯變化，表明慢病毒轉染能夠獲得穩定sh-NEAT1胃癌細胞系。通過BrdU染色[15]檢測細胞增殖發現，轉染sh-NEAT1后SGC-7901和MGC-803細胞BrdU陽性細胞率明顯減低，表明細胞增殖受到了抑制。對細胞中Ki67蛋白表達水平檢測發現，Ki67蛋白相對表達水平明顯降低，由于Ki67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，與染色質的合成、細胞有絲分裂密切相關[16]，其表達水平降低，表明能夠抑制腫瘤細胞的增殖。流式細胞術結果顯示，轉染sh-NEAT1后，SGC-7901和MGC-803細胞的凋亡率明顯升高，細胞中Caspase-3表達水平也明顯升高。Caspase-3是參與和執行細胞凋亡的重要蛋白，當凋亡信號傳遞并激活下游Caspase-3的表達時，表明細胞已進入凋亡不可逆時期[17]。NEAT1表達沉默后，胃癌細胞的增殖能力明顯降低，凋亡水平明顯升高，可見NEAT1能夠通過促進細胞增殖抑制細胞凋亡發揮原癌基因的作用。

上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞暫時喪失細胞極性并有間質細胞特征，獲得移動能力。本研究通過Transwell小室和劃痕實驗分析NEAT1沉默對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響，結果顯示，沉默NEAT1后，胃癌SGC-7901和MGC-803的侵襲能力和遷移能力明顯受到抑制。Western blot分析顯示，腫瘤細胞中E-cadherin表達水平顯著提升，N-cadherin表達水平明顯下降，由于細胞發生EMT過程中，腫瘤細胞通過改變自身細胞形態，喪失細胞極性，與其他細胞分離，形成偽足，增強自身的遷移能力[18-19]。同時通過下調細胞黏附因子E-Cadherin的表達[20]，上調質型細胞標記物如波形蛋白(Vimentin)[21]、N-Cadherin表達，將角蛋白細胞骨架變為波形細胞骨架，促進細胞穿透胞間連接，增強細胞的侵襲能力[22]。沉默NEAT1的表達后，SGC-7901和MGC-803細胞的N-cadherin的表達顯著降低，表明其EMT機制顯著受到抑制，從而降低腫瘤細胞的侵襲能力。

本研究結果顯示，miR-126在胃癌細胞中的相對表達水平明顯低于正常胃上皮細胞GES-1，與Rouigari等[23]關于miR-126能夠發揮抑癌作用的研究一致。NEAT1沉默后，胃癌細胞SGC-7901和MGC-803的miR-126表達水平顯著增高(P<0.05)，表明NEAT1能夠抑制miR-126表達，本研究發現miR-126是NEAT1的潛在靶向位點，miR-126作用后，NEAT1野生質粒的熒光素酶活性顯著降低，而NEAT1突變質粒的熒光素酶活性無明顯影響，這進一步證實了NEAT1靶向調控miR-126。由于NEAT1基因沉默后，胃癌細胞SGC-7901的miR-126表達水平相對高于MGC-803細胞，因此本研究選擇SGC-7901細胞研究NEAT1/miR-126對生長和運動的調節，結果顯示NEAT1沉默后使用miR-126 inhibitor能夠恢復沉默NEAT1引起的SGC-7901細胞的增殖、侵襲、遷移抑制，細胞凋亡增強的細胞表型，提示在胃癌細胞中NEAT1能夠上調miR-126表達抑制細胞增殖，通過阻斷EMT機制降低腫瘤細胞的侵襲及轉移能力。

體內移植瘤實驗表明，NEAT1基因沉默后，裸鼠腫瘤的體積增長受到抑制，但sh-NEAT1組裸鼠腫瘤質量顯著高于對照組，這可能是由于sh-NEAT1抑制腫瘤細胞的EMT機制，抑制細胞侵襲能力，促使細胞在局部增殖，從而使得腫瘤體積未變，而質量顯著增加。免疫組化結果顯示，NEAT1基因沉默后，裸鼠腫瘤組織中Ki67和N-cadherin的表達量顯著降低，而Caspase-3及E-cadherin的表達量顯著增加，表明sh-NEAT1在體內依舊能夠發揮抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用。

綜上所述，干擾長鏈非編碼RNA，NEAT1能夠上調胃癌細胞中miR-126的表達水平，通過誘導細胞凋亡以抑制胃癌細胞的增殖，同時抑制細胞的EMT機制，達到抑制腫瘤的侵襲、轉移及裸鼠腫瘤形成的目的。