氫氣對實驗性小鼠過敏性鼻炎減輕作用的研究*

嚴偉明 龍 盤 楊健松 危冬昱 張宇飛 陳梅珠 張作明 陳 濤

(1. 中國人民解放軍空軍軍醫大學航空航天臨床醫學中心,西安 710032)(2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院 福建醫科大學福總臨床醫學院 廈門大學附屬東方醫院,福州 350025)(3. 中國人民解放軍西部戰區總醫院 成都 610083)(4. 中國人民解放軍94755部隊衛生所,漳州 363000)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻喉-頭頸外科的常見病，也是常見的呼吸道變應性疾病，影響全球10 %～40 %的人口。AR主要癥狀為鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進、鼻塞等，嚴重時明顯影響日常生活[1]。研究發現，氧化應激參與了AR的發生、發展過程[2]。此外炎性介質釋放引發的持續性炎癥反應也是AR的一種重要發病機制[2]。當前鼻用糖皮質激素為治療AR的首選藥物，然而激素帶來的潛在副作用往往限制其較廣泛的運用。尋求針對AR一種有效的副作用少的治療藥物具有重要臨床意義。

氫氣是一種新型抗氧化劑，同時也被報道具有抗炎作用，其無色無味，且未見報道有副作用。運用氫氣對相關疾病進行治療研究已成為醫學研究領域的熱點之一[3]。氫氣發揮生物學效應的機制主要涉及減輕氧化應激及減少炎癥因子[4]。本研究擬運用吸入氫氣的方式，構建小鼠過敏性鼻炎模型，借助氫氣抗氧化、抗炎作用，觀察其能否對過敏性鼻炎起到治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組：BALB/c小鼠24只，雌性，7周齡，購于空軍軍醫大學實驗動物中心實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)2019-001。飼養環境：溫度為(23±2)℃，相對濕度為 55%±10%，光照周期為12 h/12 h。動物體質量從小到大依次編號為 1，2，3，…24號，對于每一個編號，分別給予一個隨機數字。按編號1～24，4只/組，共6個小組；小組內按相應的隨機數字進行排序，分別標記為“1”“2”“3”“4”，每個標記各6只，相應歸為A組(正常組)、B組(模型組)、C組(氮氧組)和D組(氫氮組)。

1.1.2主要試劑及設備：卵白蛋白(ovalbumin，OVA，Sigma #SLBH0950V)；氫氧化鋁[alumin，Al(OH)3,天津市天力化學試劑有限公司，批號20120808]；生理鹽水(normal saline，NS，華仁藥業股份有限公司，產品批號F1501051)；脫鈣液(10% EDTA Na，購于空軍軍醫大學試劑中心)；微量進樣器(50 μL，上海高鴿工貿有限公司)；氫氧混合氣體(66.7% H2和33.3% O2)，由氫氧氣霧化機(上海潓美醫療科技有限公司)電解雙蒸水生產，主要由電解槽系統和超聲霧化系統共同作用，將交流電壓轉直流電壓后，通過電解槽系統的兩電極，純水在直流電壓產生的電場和在少量食品級催化劑(食品堿)作用下發生電解效應，產生氫氣和氧氣，即：2H2O=2H2↑+O2↑；氮氧混合氣體(66.7% N2和33.3% O2)，產品編號10021120#，由陜西興化化學股份有限公司光明特氣分廠配制；組織包埋機(YABO400，常州市雅博電子設備有限公司)；自動脫水機(YABO600，常州市雅博電子設備有限公司)；旋轉石蠟切片機(Finesse 325，上海賽默飛世爾儀器有限公司)；自動恒溫攤片烤片機(GTK-2002，西安瑞豐儀器設備有限公司)；顯微鏡照相系統(BX51，奧林巴斯公司)。

1.2 過敏性鼻炎模型的建立及實驗干預

1.2.1過敏性鼻炎小鼠模型的建立：參考文獻進行過敏性鼻炎模型構建[5]。①基礎致敏：每只小鼠按50 μg OVA +2 mg Al(OH)3溶于0.3 mL NS，每2天一次，持續兩周，腹腔注射；②鼻腔激發：第15～21天，每只小鼠兩個鼻腔各點一滴(約10 μL)內含200 μg OVA生理鹽水溶液。

1.2.2實驗干預：A組小鼠不給予任何處理(不造模、不干預)；B組給予過敏性鼻炎造模處理；C組小鼠在造模過程中，每天在密閉箱中吸入氮氧混合氣體(66.7% N2+ 33.3% O2)2 h，流量3 L/min；D組小鼠在造模過程中，每天在密閉箱中吸入氫氧混合氣體(66.7% H2+ 33.3% O2)2 h，流量3 L/min。采用便攜式氣體檢測報警器儀(PGM-1600，上海華瑞科學儀器有限公司)對密閉箱中的氣體進行氫氣濃度監測，并采用氧氣濃度儀進行氧氣濃度測量，確保精確吸入固定濃度和比例的混合氣體。

1.3 檢測指標

1.3.1小鼠鼻炎癥狀行為學觀察(搔鼻子及打噴嚏)：從造模過程鼻腔激發階段(第15～21天)，每天對各組小鼠鼻腔給藥10 min內，觀察并計數小鼠搔鼻子及打噴嚏次數，連續記錄7 d。

1.3.2鼻黏膜病理組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察嗜酸性粒細胞計數：第21天觀察小鼠鼻炎癥狀后，統一頸椎脫臼處死各組小鼠，解剖獲取鼻腔，于脫鈣液中浸泡30 d；將組織進行固定、脫水、包埋、切片及HE染色，制作小鼠鼻腔HE染色病理組織切片；在高倍鏡(×400)下，選取右側鼻腔鼻中隔5個視野，進行嗜酸性粒細胞計數，并取平均數，相應記錄。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 行為學觀察

2.1.1搔鼻子次數:鼻腔激發7 d內，除正常組外，其余三組小鼠搔鼻子次數均較多，大致均呈逐漸增加趨勢(圖1)。鼻腔激發第1～2天，模型組、氮氧組與正常組搔鼻子次數的差異均有統計學意義(P<0.05)；氫氧組與正常組間差異無統計學意義(P>0.05)，而模型組、氮氧組和氫氧組三組兩兩間差異無統計學意義(P>0.05)。鼻腔激發第3～6天，各組間搔鼻子數差異無統計學意義。鼻腔激發第7天，模型組、氮氧組與正常組搔鼻子次數的差異均有統計學意義(P<0.05)；氫氧組與正常組間差異無統計學意義(P>0.05)，而三組兩兩間差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

圖1 各組小鼠搔鼻子次數統計折線圖注： *P<0.05Fig.1 The statistical broken-line graph of the numberof nose-scratching of mice in each groupNote: *P<0.05

表1 各組小鼠搔鼻子次數統計表Table 1 The statistical table of the number of nose-scratching of mice in each group

2.1.2打噴嚏次數:鼻腔激發7 d內，除正常組外(正常組小鼠未觀察到有打噴嚏現象)，其余三組小鼠打噴嚏次數較正常組多，大致呈逐漸增加趨勢；每天內模型組與正常組間差異均有統計學意義(P<0.05)；每天各組間打噴嚏次數差異均有統計學意義(P<0.05)(圖2)，具體如下：鼻腔激發第1～2天，模型組、氮氧組分別與正常組間打噴嚏次數差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，氫氧組與正常組間差異有統計學意義(P<0.05)，模型組、氮氧組和氫氧組三組兩兩間間差異無統計學意義(P>0.05)；鼻腔激發第3～4天，模型組、氮氧組分別與正常組間差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，氫氧組與正常組間差異無統計學意義(P>0.05)，模型組、氮氧組和氫氧組三組兩兩間差異無統計學意義(P>0.05)；鼻腔激發第5天，模型組、氮氧組分別與正常組間差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，氫氧組與正常組間差異有統計學意義(P<0.05)，而三組兩兩間差異無統計學意義(P>0.05)；鼻腔激發第6天，模型組、氮氧組、氫氧組分別與正常組間差異均有統計學意義(P<0.05)，而三組兩兩間差異無統計學意義(P>0.05)；鼻腔激發第7天，模型組、氮氧組、氫氧組分別與正常組間差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，氮氧組、氫氧組分別與模型組間差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，氫氧組與氮氧組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)(表2)。

表2 各組小鼠打噴嚏次數統計表Table 2 The statistical table of the number of sneezing of mice in each group

圖2 各組小鼠打噴嚏數統計折線圖注：*P<0.05Fig.2 The statistical broken-line graph of thenumber of sneezing of mice in each groupNote:*P<0.05

2.2 病理組織學觀察

在鼻腔黏膜病理組織HE染色切片上，模型組、氮氧組和氫氧組小鼠鼻腔均可見嗜酸性粒細胞(細胞質呈紅色，呈顆粒感，細胞核呈分葉狀)，正常組小鼠未觀察到(圖3)。在高倍鏡下，正常組、模型組、氮氧組、氫氧組的嗜酸性粒細胞計數分別為0，32.2±3.426，24.4±3.868和 19.2±2.396個；模型組、氮氧組、氫氧組分別與正常組間嗜酸性粒細胞計數差異均有統計學意義(P<0.01)；氫氧組嗜酸性粒細胞計數較模型組、氮氧組少，差異均有統計學意義(P<0.01)，而氮氧組與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖3 各組間小鼠鼻中隔黏膜病理組織切片HE染色典型圖(Bar=10 μm)Fig.3 Typical image of HE staining of the histological sections of the mucosain the nasal septum of mice in each group (Bar =10 μm)

圖4 各組間小鼠鼻中隔黏膜病理組織切片黏膜嗜酸性粒細胞計數統計圖注:正常組未觀察到；與正常組相比，**P<0.01; 與氮氧組相比，##P<0.01Fig.4 The statistics chart of the eosinophil numbercounted in the histological sections of the mucosain the nasal septum of mice in each groupNote:Not detected in the normal group；Compared with the normal group,**P<0.01；Compared with the nitrogen-oxygen group, ##P<0.01

3 討論

過敏性鼻炎臨床典型癥狀包括鼻癢、陣發性噴嚏，表現為患者陣發性打噴嚏、搔鼻子，病理組織學表現為毛細血管擴張，血管通透性增加，嗜酸性粒細胞浸潤[6]。本研究參考文獻構建的過敏性鼻炎小鼠模型，造模的小鼠打噴嚏次數明顯增加，且在鼻腔黏膜病理組織HE染色切片上觀察到過敏性炎癥的特征性細胞——嗜酸性粒細胞(細胞質呈紅色，有顆粒感，細胞核呈分葉狀)，而在正常小鼠中未發現有嗜酸性粒細胞。因此說明過敏性鼻炎小鼠模型建立成功，與上述過敏性鼻炎癥狀行為數據相吻合。

Sim等[7]研究發現過敏性鼻炎患者其體內氧化應激水平明顯升高。氧化應激可破壞上皮纖毛的完整性和功能并改變黏附分子的表達，導致滲透黏膜和黏液產生增加，從而參與AR的發病過程。Guo等[8]研究發現抗氧化劑可通過清除氧自由基治療過敏性鼻炎。此外，研究顯示在AR患者和動物模型中鼻腔灌洗液中，白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13和IL-17等炎癥因子水平明顯升高[9-10]，提示炎癥反應也是AR發病中的另一重要作用環節。在AR中，氧化應激與炎癥這兩種機制相互作用，相互調節促進AR的發生、發展[11]。

氫氣是一種新型抗氧化劑，可清除強效氧自由基，如—OH和ONOO—[12-13]，可起到生物學保護效應。研究發現呼吸高壓強的氫氣可治療寄生蟲引起的肝炎，證明氫氣具備抗炎特性[14]。氫氣可通過抑制炎癥性組織損傷，降低炎癥因子和細胞因子，如白介素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞黏附分子-1和前列腺素E2等[15]，減輕組織器官損傷[16-17]。

本研究利用氫氧氣霧化機電解雙蒸水產生含高濃度氫氣的混合氣體(66.7% H2和33.3% O2)干預AR小鼠，作為對照的小鼠給予吸入氮氧混合氣體(66.7% N2和33.3% O2)，借用氫氣的抗氧化、抗炎作用嘗試去治療過敏性鼻炎，從小鼠行為學及病理組織學結果發現氫氣對小鼠過敏性鼻炎癥狀(打噴嚏次數)及病理組織學改變(鼻腔黏膜嗜酸性粒細胞計數)有減輕作用。我們觀察到正常組小鼠也有搔鼻子的現象，可能是其在進行臉面清洗，而對其余三組小鼠，人為觀察可能不容易將此動作與真正因鼻炎引起鼻癢而進行搔鼻子的動作區別開來。這可能是本研究中小鼠搔鼻子次數指標中未見到吸氫小鼠與其他組明顯差異的原因。

前期有研究顯示應用富含氫氣的生理鹽水干預AR鼠，發現其可通過降低血清嗜酸性粒細胞陽離子蛋白水平來抑制活性嗜酸性粒細胞[18]；另有研究應用富含氫氣的生理鹽水輔助治療AR患者，結果證實其對AR患者過敏癥狀也有一定改善作用[19]。文獻報道吸入氫氣在多種疾病模型中有較好的治療效果，相對于腹腔注射氫水的形式，吸入氫氣所可提供的氫氣濃度較高，在體內達峰時濃度較大，持續時間較長[20-22]。因此，在某種意義上，吸入氫氣能取得更佳的疾病防治效果。本研究運用吸入氫氣形式干預AR的結果與上述氫氣其他研究結果相吻合。

值得關注的是，本研究結果可見氮氧混合氣體、氫氧混合氣體處理均能減輕過敏性鼻炎小鼠打噴嚏癥狀，而氫氧混合氣體處理組的效果更佳，說明氫氣對過敏性鼻炎打噴嚏癥狀有一定的減輕作用。而氮氧混合氣體組小鼠打噴嚏癥狀較模型組有所減輕，是否可以說明33.3%氧對過敏鼻炎也有一定的影響？目前未查閱到這方面相關文獻報道，有待后續相關研究進一步證實。Fang等[23]的研究中，其用氮氣將吸的氧氣濃度稀釋為21%，與周圍環境相同，排除了高濃度氧氣的影響在小鼠身上，其研究結果也發現氫氣可以減輕小鼠過敏癥狀。這與本研究結果相符合。

綜上所述，本研究數據說明高濃度氫氣吸入對小鼠過敏性鼻炎有一定的治療作用，其發揮作用的深入具體機制有待進一步實驗探討。