拮抗茶輪斑病菌生防木霉菌的篩選、鑒定與應用

盧聲潔， 趙興麗， 羅林麗， 張 欣， 程宇豪， 張金峰， 李 帥， 周玉鋒*

(1.貴州大學 茶學院， 貴州 貴陽550025； 2.貴州省農業科學院 生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省農業科學院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶是一種直飲品，茶葉的安全直接關乎飲茶者的健康。中國是世界上種植茶樹面積最廣、茶葉產出最多的國家。據統計，2019年我國的茶園總面積達306.52萬hm2；干毛茶產量達279.34萬t，位居世界第一[1]，且我國的茶園面積和茶葉產量仍呈不斷增長趨勢。茶輪斑病是茶樹重要的葉部病害，開展對茶輪斑病菌具較好拮抗作用生防木霉菌的篩選，對生物防治茶輪斑病及拓寬生防木霉菌的田間應用具有重要意義。【前人研究進展】茶輪斑病是茶樹栽培生產中一類主要的葉部病害，病原為擬盤多毛孢屬(PestalotiopsisSteyaert)真菌，病菌通常侵染成熟葉片，影響茶樹正常生理代謝，導致茶葉減產，甚至引發茶樹死亡[2-3]。生產上多采用化學農藥防治該病害，但長期施用化學農藥不僅使病原菌產生抗藥性，達不到防治效果[4-5]；同時，化學農藥的過量施用也對茶葉品質、茶園生態及人體健康造成威脅[6-7]。近年來，隨著我國化學農藥減施增效戰略實施，茶園減施化學農藥成為必然趨勢[8-9]。生物防治具有綠色、安全、無抗藥性及無污染等優勢，是推進茶園有害生物進行無害化治理的研究熱點，生防菌作為化學農藥的替代品得到越來越多研究者的青睞。有研究發現，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)和綠粘帚霉(Gliocladiumvirena)等生防菌對茶輪斑病菌具有較好的防治效果[10]；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)不僅對茶輪斑病病菌有明顯抑制作用，室內盆栽條件下平均防效可達77.6%[11-12]，同時，對氯氰菊酯也表現出較強的降解能力；接種茶輪斑病菌前先接種木霉菌，可有效抑制茶輪斑病菌的侵染[13]。【研究切入點】木霉菌(Trichodermaspp.)具有生長速度快、繁殖能力強、抑菌譜廣、能提高植物抗性和促進植物生長等優勢，是目前應用較為廣泛的生防真菌之一[14]。目前有關應用生防木霉菌防治茶輪斑病菌的研究國內雖已有文獻報道，但在貴州鮮見相關文獻報道。研究立足本地茶園生境，分離能定殖于茶樹根際的木霉菌，不僅能豐富當地木霉菌資源，而且可為生防木霉菌的開發利用拓寬途徑。【擬解決的關鍵問題】篩選對茶輪斑病有明顯抑制效果的木霉菌，并通過田間試驗探究木霉發酵液對茶葉品質的影響，以期為茶輪斑病的生物防治及木霉菌的田間應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌株 茶輪斑病病原菌菌株ZYP04-5(Neopestalotiopsisellipsospora)為貴州省生物技術研究所重點實驗室特色作物病害研究室分離保存。

1.1.2 土樣 共計29份土樣，于2019年9月至2020年4月采自貴州省都勻市、興義市、安龍縣、獨山縣和湄潭縣健康茶園的茶樹根際土壤，

1.1.3 試劑 葡萄糖、瓊脂、虎紅鈉鹽及氯霉素，市購；蒸餾水，自制。Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4和ITS5[15]，EF1-728F/EF1-986R[16]，均由上海生工生物有限公司合成。

1.1.4 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、PDB液體培養基和虎紅酸鈉培養基，自制，滅菌后備用[17]。

1.2 方法

1.2.1 茶樹根際木霉菌的分離 采用梯度稀釋法對采集的茶樹根際土樣進行木霉菌株分離。稱取5 g風干土樣倒入裝有45 mL無菌水的錐形瓶中，28℃、150 r/min振蕩培養30 min，充分混勻后靜置30 s，取上清液獲得濃度為10-1倍的土樣懸液。無菌條件下逐一稀釋成10-2倍、10-3倍和10-4倍土樣稀釋液，靜置后用移液槍分別取濃度為10-3倍和10-4倍土樣稀釋液的樣品懸液100 μL滴于虎紅酸鈉培養基平板上，無菌涂布棒涂勻后封口，28℃培養箱中黑暗、倒置培養，待有菌落形成后將其轉接至新鮮PDA培養基上純化，得到純化菌株后用硫酸紙袋進行低溫保存(-20℃)。

1.2.2 茶輪斑病菌拮抗木霉菌的篩選

1) 平板對峙初篩。采用2點對峙法篩選對茶輪斑病菌具有競爭作用的木霉菌。在距離PDA平板中心2.5 cm處的直徑上分別接種直徑均為6 mm的培養7 d的木霉菌菌餅和茶輪斑病菌菌餅，3次重復，以單接茶輪斑病菌為對照，25℃避光培養7 d后測量并計算木霉菌對茶輪斑病菌的抑制效果。

2) 抑菌圈復篩。無菌條件下取8個直徑6 mm的木霉菌菌餅接種至120 mL的PDB培養基中，28℃、180 r/min條件下振蕩培養7 d，靜置2 d，經滅菌過濾紙初步過濾后，7 830 r/min常溫離心10 min，取上清液通過0.22 μm濾膜。按10%的比例將木霉菌發酵液加至PDA培養基中，混勻倒平板，取茶輪斑病菌餅(直徑6 mm)接種于平板中央，3次重復，以加等量無菌水為對照。25℃培養7 d，十字交叉法測量茶輪斑病菌菌落半徑，計算其抑菌效果。

3) 木霉發酵液處理對茶葉品質的影響。試驗在貴州省茶葉研究所茶園實施。將室內篩選得到的有明顯拮抗效果的木霉發酵液采用常規噴霧法噴施于茶樹蓬面，以噴施清水為對照，用量8 L，3次重復，小區面積約33 m2，共約150株茶樹，隨機區組排列。30 d后采集50 cm×50 cm樣框中一芽2葉，茶樣帶回實驗室后，先用微波爐中火進行殺青處理90 s；再置于80℃烘箱中進行烘干處理，干樣內含物依托貴州省茶葉研究所采用高效液相法檢測茶葉品質。

1.2.3 木霉菌株鑒定

1) 形態學觀察。挑取培養7 d的木霉菌菌落制成水玻片，于顯微鏡下觀察木霉菌分生孢子梗和分生孢子等的形態特征。

2) 分子鑒定。收集木霉菌菌絲及分生孢子，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA；采用真菌引物ITS1/ITS4[15]和EF1-728F/EF1-986R[16]分別擴增該菌株的ITS和EF-1α序列。擴增產物送于上海生工生物有限公司進行測序。測序結果經Gene Bank中的BLAST比對分析后下載相似性較高的序列，采用BioEdit進行比對和校正；利用MAGA 6.0將ITS和EF-1α基因序列連接起來，比對拼接后的序列采用RA×ML構建系統進化樹，確定該菌與同屬菌株間的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 茶輪斑病菌拮抗木霉菌的分離

根據木霉菌的生長特性和菌落形態特征，從29份茶樹根際土樣中分離純化出木霉菌35株。以茶輪斑病菌ZYP04-5為靶標菌，采用平板對峙法共篩選出7株對菌株ZYP04-5生長具有明顯抑制效果的木霉菌，7 d后各處理病原菌的生長半徑為1.317～1.400 cm，與CK間差異顯著；抑菌率為71.07%～72.43%，均達70%以上(圖1和表1)。對7株木霉菌進行抑菌圈復篩，僅有菌株BLS17112505和菌株DS-GSC-3表現抑制作用，其病原菌的生長半徑分別為3.09 cm和1.17 cm，與CK間及二者間差異均顯著。其中，菌株DS-GSC-3發酵液的抑菌效果最好，對病原菌ZYP04-5的抑制率達70.53%(表2)。

注：CK為對照，單接種病原菌，其余為木霉菌與病原菌對峙培養；同一平板中左側為病原菌ZYP04-5，右側為木霉菌。

表1 木霉菌株對茶輪斑病菌的抑制效果

表2 木霉菌株發酵液對茶輪斑病菌的抑制效果

2.2 木霉發酵液處理茶葉的品質

從表3看出，木霉菌株DS-GSC-3的發酵液處理茶樹后，茶葉內含物中氨基酸含量為1.97%，較CK增加13.87%；兒茶素含量為6.96%，較CK增加8.92%。

表3 木霉發酵液處理茶葉的品質

2.3 拮抗木霉菌株的種類鑒定

2.3.1 形態學特征 從圖2看出， 在PDA培養基上培養3 d時，菌株DS-GSC-3的菌落長至整個培養皿的2/3左右，菌落呈白色，氣生菌絲較少，無分生孢子產生；培養至7 d時，產生大量黃綠色分生孢子，聚集于菌落外圈，形成同心輪紋，無色素和特殊氣味產生。在PDA培養基上可產生半球狀分生孢子簇，散生，黃綠色或灰綠色，均呈棉絮狀。菌絲無色透明，具隔膜，直徑為3.35～4.84 μm；分生孢子梗松散對生于節上，在梗頂部瓶梗2～4個呈直角生出，安瓿瓶形；分生孢子黃綠色，亞球形至卵圓形，光滑，直徑為2.03～3.31 μm，無厚基孢子。

注：A為菌落正面，B為菌落反面，C為菌絲及分生孢子梗，D為分生孢子。

2.3.2 分子生物學鑒定 對菌株DS-GSC-3基因組DNA的ITS和EF-1α片段進行PCR擴增，測序后得到序列長度分別為498 bp和575 bp的片段。將序列提交NCBI比對分析后，選取并下載與菌株DS-GSC-3序列相似性高的菌株為內群，以Nectriaberolinensis和Nectriaeustromatica為外群構建系統發育樹 (圖3)，菌株DS-GSC-3以99%的支持率與Trichodermabrevicompactum聚為一枝。結合該菌株形態學特征確定，菌株DS-GSC-3為短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

圖3 基于 ITS和 EF-1α構建的系統發育樹

3 討論

自1932年WEINDLING[18]首次發現木霉菌對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌絲有重寄生作用后，有許多關于利用木霉菌防治植物病原真菌、細菌及病原線蟲等的研究報道[14]。如木霉菌株SMF2可有效抑制姜瘟青枯假單胞菌[19]；木霉菌Tr16和Tr50對桑椹菌核病病原菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)有明顯拮抗作用，發酵液的10倍稀釋液田間防效可達91.27%和82.53%，優于80%多菌靈500倍稀釋液的防治效果[20]；哈茨木霉菌TRI2對田間黃瓜根結線蟲的防治效果可達72.2%，與阿維菌素的防治效果相近[21]；綠色木霉制劑36 kg/hm2處理大白菜可有效降低軟腐病和其他病害的發病率，增產達63.33%[22]；茶樹修剪后噴施木霉菌制劑，可有效抑制茶枝梢黑點病和茶根腐病發生[23]。可見，利用木霉菌防治茶輪斑病菌具有一定的可行性。據報道，現有超過250余種木霉商業化殺菌劑在全球范圍內登記上市[24]，木霉在植物病害生物防治方面已展現出巨大的應用潛力。茶輪斑病發生危害對茶樹長勢、茶葉品質和產量影響較大，因此，分離篩選高效的生防木霉菌，合理利用生物防治手段控制茶輪斑病為害具有十分重要的現實意義。

4 結論

研究立足茶園生境，分離能定殖于茶樹根際的木霉菌，平板對峙和抑菌圈相結合篩選獲得對茶輪斑病菌具有拮抗作用的木霉菌株DS-GSC-3，該菌株對茶輪斑病菌的生長抑制率為72.12%，發酵液對茶輪斑病菌的抑菌率為70.53%；發酵液噴施茶蓬30 d后，較對照分別提高茶葉中氨基酸和兒茶素含量13.87%和8.92%。結合形態學特征和分子發育分析，確定菌株DS-GSC-3為短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。短密木霉菌株DS-GSC-3的發現為豐富木霉菌的開發利用拓寬了途徑，并為木霉菌防治茶輪斑病奠定了一定的理論基礎。關于短密木霉DS-GSC-3對茶輪斑病病原菌的拮抗機理、抗菌活性物質以及適于田間防控應用的劑型研發應用還需深入開展研究。