草莓根腐病病原菌鑒定及其防治藥劑篩選

熊明國， 高欣梅

(商丘職業技術學院， 河南 商丘 476006)

0 引言

【研究意義】草莓具有較高的經濟價值，在我國的水果產業中占有重要地位。近年來，草莓種植業得到快速發展，種植面積不斷增加，主要以塑料大棚、日光溫室種植方式為主，高濕、連作重茬等導致草莓根部病害加重，對草莓的品質和產量產生嚴重影響。【前人研究進展】草莓根腐病是常見的土傳病害，病原菌種類超過20種[1]。目前已發現導致草莓根腐病發生的病原菌多達20余種[2-3]，且不同地區和品種間的致病菌種類差異較大。有研究指出，河南省商丘市草莓豐香根腐病病原菌主要是鏈格孢菌[4]；北京地區草莓根腐病的病原菌為雙核絲核菌[5-6]，而河北承德地區的病原菌為立枯絲核菌[5]；安徽省長豐縣草莓根腐病病原均為尖孢鐮刀菌[7]；山東省青島市草莓根腐病的病原菌有棒形擬盤多毛孢菌、膠孢炭疽菌[8]。目前，治療草莓根腐病多采用化學藥劑進行防治。由于市面上常見的藥劑類型多樣，病原菌具有多樣性、根腐病發病具有滯后性，加之頻繁使用化學農藥等原因，導致抗藥性加快，防治效果不理想[9]。【研究切入點】河南省南陽市素有“草莓之鄉”之稱，但是近年來草莓根腐病頻繁發生，病情嚴重時甚至導致絕收[4]。目前，針對河南省南陽市草莓根腐病的病原菌鑒定和防治研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】于2018年10月在河南省南陽市唐河縣代莊村種植園采集具有草莓根腐病典型癥狀的發病植株，通過病原菌分離純化、致病性檢測結合形態學與分子生物學鑒定等對其致病病原菌種類進行鑒定，同時采用室內毒力測定與田間防治相結合，對比和分析甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑的防治效果，以期為有效控制當地及類似地區的草莓根腐病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株樣品 2018年10月于河南省南陽市唐河縣代莊村連作3年的草莓種植園采集具有典型癥狀的發病植株，品種為豐香和隋珠，各品種長勢均勻，處于收獲初期。

1.1.2 試劑 馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)培養基，自制；察氏(Czapek)培養基，北京索萊寶科技有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)通用引物，北京天根公司。

1.1.3 藥劑 70%甲基硫菌靈(施用劑量1 200 g/hm2)，河北青園有限公司；殺毒礬(有效成分56%代森錳鋅+8%惡唑烷酮，施用劑量3 000 g/hm2)，安陽市五星農藥廠；15%多抗霉素(施用劑量15 000 g/hm2)，山東省德州祥龍生化有限公司；3億孢子/g哈茨木霉(施用劑量1 500 g/hm2)，濟寧玉園生物科學有限公司；0.1億孢子/g寡雄腐霉(施用劑量300 g/hm2)，北京比奧瑞生物科技有限公司；1 000億芽孢/g枯草芽孢桿菌(施用劑量1 500 g/hm2)，河北閏沃生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法[10]對病原菌進行分離。用清水洗凈患病草莓植株根部，于病健交界位置剪取長約0.5 cm的組織，先放入70%乙醇中消毒10 s，再放入0.1% HgCl2中浸泡30 s，無菌水沖洗并用無菌濾紙吸干水分后，將其接種至PDA培養基上，25℃培養箱中培養2～3 d。待菌落長出后，用接種環挑取少量菌落進行純化，獲得菌株保存備用。

1.2.2 病原菌的致病性檢測 純化后菌株的形態特征與培養性狀完全一致，隨機挑選3個菌株M1、M2和M3，采用傷根接種法測定其致病性[11-14]。菌株接種至PDA培養基上于28℃培養7 d，用打孔器打取直徑5 mm的菌餅備用，同時制備濃度1.5×107個/mL的孢子懸浮液備用。于草莓根部造成微傷口，每株灌入孢子懸浮液25 mL，3次重復，每重復為3株，以灌入無菌水的處理作對照。將接種植株在22℃培養箱中保濕培養，接種2周后調查發病情況。將菌餅接種至草莓幼苗上，并置于20℃、70%相對濕度溫室中培養，14 d后觀察草莓植株發病情況，3次重復，每重復處理3株，以未接種的植株作對照。

1.2.3 病原菌鑒定

1) 形態學鑒定。將分離的菌株接種至PDA培養基上，25℃黑暗培養7 d后觀察并記錄菌落的形態特征。待病原菌產孢后制作玻片，觀察其產孢細胞和分生孢子的形態結構，根據形態特征進行病原菌的初步鑒定。

2) 分子生物學鑒定。將分離的菌株接入Czapek培養基，28℃振蕩培養7 d，離心后將沉淀收集，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。利用引物ITS1和ITS4對病原菌基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應總體積為25 μL：10×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物均0.5 μL，DNA模板0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。反應程序：95℃預變性4 min；95℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸60 s，35個循環；72℃延伸6 min，最后于5℃終止反應。將PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照，送至上海生工生物工程有限公司測序。用DNAStar對所測得的原始序列進行數據處理，并將測序結果在GenBank上進行同源性比較，然后利用MEGA 5.1將獲得病菌的ITS序列與NCBI網站上已發表的相似菌株的ITS序列進行系統發育樹分析。

1.2.4 藥劑室內毒力測定 采用生長速率法[15]測定甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對分離的草莓根腐病菌的毒力。用PDA培養基配制藥劑培養基平板，無菌水培養基作對照，3次重復，用打孔器在菌落邊緣切下直徑為70 mm的菌餅接種至培養基平板中央，于25℃培養5 d(對照基本長滿培菌養皿)，采用十字交叉法測出各菌落直徑，并計算抑菌率。

1.2.5 田間防治效果 試驗在河南省南陽市唐河縣代莊村種植園進行，豐香(1號棚)和隋珠(2號棚)2個品種各1個棚，試驗各設7個處理，每個藥劑1個處理，劑量采用生產廠家推薦劑量，以清水噴施為對照(CK)，3次重復，不設置濃度梯度，比較甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對草莓根腐病的防治效果。1號棚、2號棚各小區面積均為17 m2(6.8 m×2.5 m)。每次重復處理50株草莓，隨機區組排列。2個棚區的草莓植株長勢一致，各小區均實施相同的肥水管理，草莓根腐病為自然發病。各藥劑于草莓定植后7 d進行第1次灌根處理，60 d后再施藥1次。于第2次施藥后30 d調查記錄植株的發病情況。各小區均采用對角線五點取樣法，每點取3株，統計并計算發病率和防效。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態學鑒定

發病植株地上部分長勢衰弱，葉片下垂，不同程度變黑腐爛，果實無法自然膨大，整株萎蔫(圖1)；地下部分須根較少且較細，表皮呈現褐色病斑，須根后期變黑并腐爛，表皮與木質部發生分離。從病株上分離到22個菌株，且特征較為一致。由圖1可見，在PDA培養基上生長4 d后，菌落呈白色，菌絲絨狀且大多數呈分支狀、含有大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子較為勻稱，呈鐮刀狀，具有1～4個隔膜，但大多數具有3～4個隔膜，大小為(23.5～42.8)μm×(2.8～5.6)μm。小型分生孢子呈腎形或卵形，具有0～1個隔膜，大小為(6.6～22.7)μm×(2.3～3.7)μm，產孢細胞上著生假頭狀。綜合以上形態學特征，初步認為草莓根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：a為草莓根腐病發病株田間癥狀，b為病原菌菌落，c為病原菌分生孢子。

2.2 病原菌的致病性

從圖2看出，接種21 d后植株的發病癥狀明顯，葉片的尖部出現脫水并逐漸變為灰綠色，最終整株死亡。將發病植株取出發現，根系已腐爛變黑。癥狀與草莓根腐病田間自然發病癥狀一致。對照組生長正常，未出現發病癥狀。再次對發病植株的病變組織進行病原菌分離，結果目標分離物的獲得率為100%，表明再分離獲得的菌株與原接種病菌一致，為河南省南陽市唐河縣代莊村種植園草莓根腐病的病原菌。

圖2 回接試驗草莓植株的發病癥狀

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

從圖3看出，將菌株M1、M2和M3的基因組DNA用rDNA-ITS進行PCR擴增、測序，均得到大小約360 bp的特異性片段，且序列相同，在GenBank中的登錄號分別為MN507109、MN507110和MN507111。利用NCBI數據庫，將片段序列進行Blast比對，菌株M1、M2和M3的序列與菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登錄號：EF056790)和NRRL22518(登錄號：FJ985265)的序列同源性最高，為99%以上。由圖4可知，菌株M1、M2、M3與菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登錄號：EF056790)和NRRL22518(登錄號：FJ985265)為同一分支，支持率高達100%。由此進一步確定分離菌株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：M為DNA Marker，1～2泳道為菌株M1，3～4泳道為菌株M2，5～6泳道為菌株M3。

圖4 分離菌株rDNA-ITS序列的系統發育樹

2.4 6種藥劑對病原菌的室內毒力測定

從圖5看出，6種藥劑對尖孢鐮刀菌均有不同程度的毒力作用，其毒力強度為甲基硫菌靈>哈茨木霉>枯草芽孢桿菌>多抗霉素>殺毒礬>寡雄腐霉。其中，甲基硫菌靈和哈茨木霉的毒力較強，其EC50分別為4.98 mg/mL和38.39 mg/mL；其次為枯草芽孢桿菌和多抗霉素，其EC50分別為57.25 mg/mL和67.98 mg/mL；殺毒礬對尖孢鐮刀菌的毒力相對較弱，其EC50為192.76 mg/mL；寡雄腐霉對尖孢鐮刀菌的毒力較弱，其EC50為610.55 mg/mL。

圖5 6種藥劑對病原菌的毒力強度

2.5 6種藥劑對豐香和隋珠根腐病的防治效果

從表1看出，不同藥劑對同一品種草莓及同種藥劑對不同品種草莓的防治效果均存在差異。其中，殺毒礬對豐香和隋珠均具有良好防治效果，防效均高達80.16%；甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌對豐香的防治效果也較好，防效也達80.16%，二者對隋珠的防治效果均為69.95%；哈茨木霉對豐香和隋珠的防治效果均為69.95%；多抗霉素對豐香和隋珠的防治效果分別為69.95%和50.18%；寡雄腐霉對豐香和隋珠的防治效果均較差，分別為50.18%和40.08%。對豐香而言，殺毒礬、甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌的防治效果較好；對隋珠而言，殺毒礬的防治效果較好，其次是甲基硫菌靈、哈茨木霉和枯草芽孢桿菌。

表1 6種藥劑對豐香草莓和隋珠草莓根腐病的防治效果

3 討論

尖孢鐮刀菌可導致草莓植株根部和葉片病害，此外，還可以引起苜蓿[16]、三七[17]、香蕉[18]及西瓜[19]等植株發病。為了防止發生病原菌抗藥性和環境污染，有益微生物防治病害已逐漸成為一種理想的途徑。室內毒力測定結果表明，6種藥劑中甲基硫菌靈對尖孢鐮刀菌的毒力最強，其次為哈茨木霉，枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌的毒力也較強；同時，各藥劑的田間防治結果表明，6種藥劑對豐香和隋珠2個草莓品種根腐病的防治效果差異較大，其中殺毒礬對豐香和隋珠的防效最佳，甲基硫菌靈、枯草芽孢桿菌對豐香和隋珠的防治效果也較為明顯。由于殺毒礬、甲基硫菌靈為化學藥劑，長期使用易造成環境污染和產品的農藥殘留，而枯草芽孢桿菌為生物藥劑，且其活性成分主要為生防類芽孢桿菌，可以在土壤、植株體內定殖，可產生抗菌物質、促進植物生長，具有較好的生防能力[20]，可減少農藥使用量，降低草莓產品的農藥殘留，因此，建議在當地大面積試驗示范推廣應用。該研究使用的生防藥劑均為單一菌劑，具有適應性不強、需菌量較大等缺陷，今后需要在多菌劑復合應用方向進行深入研究。

4 結論

通過對河南省南陽市唐河縣代莊村草莓種植園草莓根腐病樣品進行病原菌分離純化，共分離獲得22個菌株，純化后菌株的形態特征與培養性狀完全一致，形態學特征和測量值與尖孢鐮刀菌相符；隨機挑選3個菌株M1、M2、M3并進行rDNA-ITS序列測定，結果3個菌株的序列與GenBank中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)對應的序列同源性最高，為99%以上；同時，3個菌株的序列在系統發育樹上與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為同一分支，支持率高達100%。由此確定河南省南陽市唐河縣代莊村草莓種植園草莓根腐病由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)侵染所致。室內毒力測定結果表明，甲基硫菌靈對尖孢鐮刀菌的毒力最強，EC50為4.98 mg/mL；哈茨木霉其次，EC50為38.39 mg/mL；枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌的毒力也較強，EC50為57.25 mg/mL。田間防治結果表明，甲基硫菌靈、殺毒礬、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢桿菌等6種藥劑對豐香和隋珠2個草莓品種根腐病的防治效果差異較大，其中，殺毒礬對豐香和隋珠的防效最佳，均為80.16%；甲基硫菌靈和枯草芽孢桿菌的防治效果也較為明顯，均分別為80.16%和69.95%。枯草芽孢桿菌的防治效果較好，且其活性成分主要為生防類芽孢桿菌，可減少農藥使用量，降低草莓產品的農藥殘留，可在當地大面積示范推廣應用。