Sirt1抑制由ox-LDL誘導的人冠狀動脈內皮細胞的炎癥反應

魏明慧，孫浩榮，王靜文，薛明明＊

（內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心臟病、外周血管病、腦血管病等疾病的重要發病機制[1]。AS的發病率居高不下，是世界上最重要的公共衛生問題之一。中國AS的發病率也急劇上升[2]。研究表明炎癥反應參與AS發病的各個階段，在初期表現為急性滲出性炎癥，在晚期以慢性增生性炎癥為特征[3]。因此，抑制炎癥可能成為治療AS的有效方法。研究報道[4]氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）與AS、高血壓、冠狀動脈及外周動脈疾病、急性冠脈綜合征等心血管疾病密切相關，是AS的獨立危險因素。沉默信息調節因子（silent information regulator，Sirt）1作為SIRT蛋白家族中最具代表性的因子，具有脫乙酰酶活性，可修飾脂質，促進自噬，減輕炎癥，改善血管內皮細胞功能[5]。本文利用人冠狀動脈內皮細胞（human coronary endothelial cells，HCAEC）建立ox-LDL誘導的AS細胞模型，探討Sirt1對HCAEC炎癥反應的影響。以期為AS的治療提供新的藥物靶點和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

HCAEC、ECM內皮細胞培養基購自美國Sciencell公司；ox-LDL購自上海翊圣生物科技有限公司；GV146-SIRT1過表達質粒（貨號：POSE146071634）、GV102-SIRT1干擾質粒（貨號：PIEE102071634）購自上海吉凱基因有限公司；總RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN生化科技有限公司（貨號：RP120227），Lipofectamine?2000 Transfection Reagent（貨號：11668019）購自Thermo Fisher科技（中國）有限公司，Anti-GAPDH抗體-Loading Control（貨號：ab9485）、重組Anti-SIRT1抗體[EPR18239]（貨號：ab189494）、重組Anti-ICAM1抗體[EP1442Y]（貨號：ab53013）均購自Abcam上海有限責任公司；Dylight800，Goat Anti-Rabbit IgG（貨號：A23920）購自Abbkine公司；人hs-CRP ELISA試劑盒、人IL-1 ELISA試劑盒購自深圳達科為生物工程有限公司；TransStart Tip Green qPCR SuperMix、PrimeScript RT Master Mix、RNAiso Plus購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將HCAEC中加入含10%FBS的ECM培養基并置于37℃，5%CO2培養箱內，每隔24h采用半數換液原則棄掉一半培養基再加入一半新的含10%FBS的ECM培養基，當細胞融合度約為85%~90%并處于對數生長期時，以1：2的比例進行傳代培養。

1.2.2 四噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞生存率 將HCAEC以1×104/mL的濃度稀釋，接種在96孔板中，每孔100μL。在37℃，5%CO2的條件下培養24h。用ECM培養基稀釋250mg/Lox-LDL，制備25mg/L ox-LDL、50mg/Lox-LDL組、100mg/L ox-LDL組、200mg/L ox-LDL四個濃度，用ECM培養基稀釋PBS磷酸鹽緩沖液制備與200mg/Lox-LDL同等條件的PBS培養液。取出生長24h的貼壁細胞，棄去各孔中原培養液，每孔加入100L含各濃度ox-LDL的ECM培養基，每個濃度設置3個復孔，37℃、5%CO2條件下繼續培養24h。在每孔中加入20μL 5mg/mL的MTT溶液；繼續放入培養箱中避光培養4h，棄上清，各孔加入100μL DMSO，振蕩10min；全波長酶標儀上測定每孔在450nm處OD值。根據公式：細胞存活率=（樣本孔OD值—空白孔OD值）/（正常對照孔OD值—空白孔OD值）計算各濃度下細胞存活率。

1.2.3 細胞轉染與實驗分組 取對數生長期的HCAEC，以每孔2.5×105個細胞接種于24孔板中，每組三個復孔。正常對照組細胞常規培養；空質粒+正常對照組細胞轉染空載質粒；空質粒+ox-LDL組轉染空載質粒并用100 mg/L ox-LDL誘導HCAEC損傷，建立AS細胞模型；Sirt1過表達+ox-LDL組、Sirt1干擾+ox-LDL組分別轉染Sirt1過表達和Sirt1干擾重組質粒并用100 mg/L ox-LDL誘導HCAEC損傷，建立AS細胞模型。用LipofectamineTM2000轉染試劑介導質粒轉染，48h后在熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉染情況。

1.2.4 qRT-PCR檢測Sirt1和ICAM-1的mRNA表達水平 提取各組細胞總RNA，逆轉錄的cDNA為模板，構建20μL的反應體系，使得正反向引物的終濃度為0.3M；設定95℃，15min預變性；95℃，10s，60℃，32s共40個循環進行變性、退火、延伸并采用7500 Fast檢測系統、SuperReal PreMix Plus、表1中的引物序列進行聚合酶鏈式反應。使用2-ΔΔCt對qPCR結果進行定量，以GAPDH作為內參，每個樣品重復3次。

表1 用于熒光定量聚合酶鏈式反應的引物序列Fig.1 Primers sequences used for reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction analysis.

1.2.5 Western Blot分析Sirt1、ICAM-1的蛋白表達水平 用含有1%蛋白酶抑制劑（PMSF）的蛋白裂解液RIPA充分裂解細胞，并將裂解物在4℃下12000r離心20min取上清；將等量的蛋白以每孔10μg的量進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移到PVDF膜上；在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5h，并在4℃分別用Anti-GAPDH抗體-Loading Control（貨號：ab9485）、重組Anti-SIRT1抗體[EPR18239（]貨號：ab189494）、重組Anti-ICAM1抗體[EP1442Y]（貨號：ab53013）以1：1000的比例稀釋后孵育過夜；最后將膜與Dylight800，Goat Anti-Rabbit IgG（貨號：A23920）室溫孵育2h，并用雙色紅外激光成像系統（LI-COR公司）進行掃膜成像；結果用目的基因的灰度值/GAPDH的灰度值表示。

1.2.6 ELISA法檢測IL-1、hs-CRP表達 用無菌EP管收集各組的上清液，以10μL/孔加入樣本孔內，再加入40μL樣本稀釋液；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；隨后在每孔內加入辣根過氧化氫酶標記的檢測抗體100μL 37℃水浴60min；棄去孔內液體，用洗滌液洗板5次；每孔加入底物A、B各50L37℃避光孵育15min；最后每孔加入50uL終止液，在450nm波長處測定各孔OD值；根據標準品孔的OD值繪制標準曲線，并將樣本孔的OD值代入到標準曲線，計算樣本孔IL-1、hs-CRP的濃度。

1.3 統計學分析

所有實驗數據用來表示并利用SPSS 22.0進行統計學分析。多組間比較用單因素方差分析，組間的兩兩比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 100 mg/L ox-LDL成功誘導HCAEC構建AS細胞模型

將正常對照組的細胞存活率定為100%，而其他組的細胞存活率以對照組的百分比表示；MTT試驗結果顯示，與正常對照組相比，PBS對照組的細胞存活率無顯著差異（P>0.05）。然而，隨著ox-LDL濃度的進一步增加，細胞存活率逐漸降低，在200 mg/L ox-LDL組細胞存活率顯著降低（P<0.05）（見圖1）。這些結果表明ox-LDL以劑量依賴的的方式降低細胞存活率。因此，在以下實驗中排除200mg/L ox-LDL組。為了進一步篩選出誘導炎癥的最適ox-LDL濃度，通過qRT-PCR和Western Blot檢測了誘導炎癥部位黏連性的ICAM-1表達的變化；ELISA法檢測各組細胞上清中炎癥因子IL-1、hs-CRP的表達變化。與正常對照組相比，50 mg/L ox-LDL組ICAM-1的mRNA以及蛋白顯著升高（P<0.05），而100 mg/L ox-LDL組升高更為顯著（P<0.01）。然而，其他組與正常對照比較均無顯著差異（見表2，圖2）。與對照組相比，上清液中炎癥因子IL-1、hs-CRP蛋白表達量在100 mg/L ox-LDL組均顯著升高（P<0.01），IL-1蛋白表達量在50mg/L ox-LDL組也顯著升高（P<0.05），但沒有100 mg/L ox-LDL組升高明顯，其余組與正常對照組間也無顯著差異（見表3）。

圖1 不同濃度ox-LDL對細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ox LDL on cell viability

表2 各組HCAEC中ICAM-1的mRNA表達情況（±s）Tab.2 Expression of ICAM-1 mRNA in HCAECof each group（±s）

表2 各組HCAEC中ICAM-1的mRNA表達情況（±s）Tab.2 Expression of ICAM-1 mRNA in HCAECof each group（±s）

注：與正常對照組比較，#P<0.05，＊P<0.01

組別nmRNA（相對于正常對照組）正常對照組31 PBS組31.051±0.085 25 mg/L ox-LDL組31.069±0.063 50 mg/L ox-LDL組31.478±0.063#100 mg/L ox-LDL組32.041±0.071*

圖2 不同濃度ox-LDL對ICAM-1蛋白表達的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ox-LDL on ICAM-1 protein expression

表3 各組細胞上清液中炎癥因子的比較（±s）Tab.3 Comparison of inflammatory factors in cell supernatan（t±s）

表3 各組細胞上清液中炎癥因子的比較（±s）Tab.3 Comparison of inflammatory factors in cell supernatan（t±s）

注：與正常對照組比較，#P<0.05，＊P<0.01

組別nIL-1（pg/mL）hs-CRP（pg/mL）正常對照組31.621±0.0611.663±0.045 PBS組31.602±0.0391.656±0.057 25μg/mL ox-LDL組31.646±0.0461.848±0.126 50μg/mL ox-LDL組31.731±0.0344.511±0.139#100μg/mLox-LDL組32.889±0.113*7.366±0.240*

2.2 Sirt1成功轉入AS模型細胞并表達

重組質粒含有EGFP綠色熒光報告基因，轉染48 h后轉染了空質粒、Sirt1干擾、Sirt1過表達的細胞在熒光顯微鏡下可見綠色熒光標記。而正常對照組的細胞未見綠色熒光（見圖3）。為了進一步驗證目的基因Sirt1是否成功表達，通過qRT-PCR和Western Blot檢測各組細胞Sirt1的表達情況。正常對照組細胞與轉染空質粒的對照組間無顯著差異（見表4，圖4）。與轉染空質粒的對照組相比，轉染空質粒的模型組Sirt1 mRNA及蛋白表達量顯著降低（P<0.05）。與轉染空質粒的模型組相比，轉染Sirt1過表達質粒的模型組Sirt1 mRNA及蛋白表達量顯著升高（P<0.05），而轉染干擾質粒的模型組Sirt1 mRNA及蛋白表達量則顯著降低（P<0.05）。

圖3 各組細胞質粒轉染情況.標尺：500μm.Fig.3 Plasmid transfection in each group.Scale:500μm.

表4 各組細胞中Sirt1的mRNA和蛋白表達情況（±s）Tab.4 Expression of Sirt1 mRNAand protein in each group（±s）

表4 各組細胞中Sirt1的mRNA和蛋白表達情況（±s）Tab.4 Expression of Sirt1 mRNAand protein in each group（±s）

注：與空質粒對照組比較，#P<0.05；與空質粒+ox-LDL組比較，＊P<0.05

組別nmRNA（相對于正常對照組）正常對照組31空質粒對照組30.995±0.096空質粒+ox-LDL組30.480±0.101#Sirt1過表達+ox-LDL組31.992±0.100*Sirt1干擾+ox-LDL組30.167±0.076*

圖4 各組細胞Sirt1蛋白的表達Fig.4 Expression of Sirt1 protein in each group

2.3 S irt1減輕ox-LDL誘導的HCAEC炎癥反應

為了證實Sirt1對于ox-LDL誘導的HCAEC炎癥反應的影響，通過qRT-PCR和Western Blot檢測了促進炎癥部位黏連的ICAM-1。正常對照組與空質粒對照組間無顯著差異；與空質粒對照組相比，空質粒+ox-LDL組ICAM-1 mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）；與空質粒+ox-LDL組比較，Sirt1過表達+ox-LDL組ICAM-1 mRNA表達水平顯著降低，而Sirt1干擾+ox-LDL組則顯著升高（P<0.05）。這些結果通過Western Blot得到了進一步證實（見圖5）。此外通過ELISA法檢測各組細胞上清中炎癥因子IL-1、hs-CRP表達水平，與空質粒對照組相比，空質粒+ox-LDL組IL-1、hs-CRP表達水平升高（P<0.05）；與空質粒+ox-LDL組比較，Sirt1過表達+ox-LDL組IL-1、hs-CRP表達水平顯著降低，而Sirt1干擾+ox-LDL組IL-1、hs-CRP表達水平則顯著升高（P<0.05）（見表6）。

表5 各組HCAEC中ICAM-1 mRNA及蛋白的表達情況（±s）Tab.5 Expression of ICAM-1 mRNA and protein in HCAEC of each group（±s）

表5 各組HCAEC中ICAM-1 mRNA及蛋白的表達情況（±s）Tab.5 Expression of ICAM-1 mRNA and protein in HCAEC of each group（±s）

注：與空質粒對照組比較，#P<0.05；與空質粒+ox-LDL組比較，＊P<0.05

組別nmRNA（相對于正常對照組）正常對照組31空質粒對照組31.007±0.007空質粒+ox-LDL組32.182±0.496#Sirt1過表達+ox-LDL組30.542±0.150*Sirt1干擾+ox-LDL組36.574±0.524*

圖5 各組細胞ICAM-1蛋白的表達Fig.5 Expression of ICAM-1 protein in each group

表6 各組HCAEC中IL-1、hs-CRP水平的比較（±s）Tab.6 Comparison of IL-1 and hs-CRP levels in HCAEC of each group（±s）

表6 各組HCAEC中IL-1、hs-CRP水平的比較（±s）Tab.6 Comparison of IL-1 and hs-CRP levels in HCAEC of each group（±s）

注：與空質粒對照組比較，#P<0.05；與空質粒+ox-LDL組比較，＊P<0.05

組別nIL-1（pg/mL）hs-CRP（pg/mL）正常對照組31.629±0.1121.603±0.136空質粒對照組31.644±0.0941.602±0.141空質粒+ox-LDL組32.718±0.277#7.204±0.628#Sirt1過表達+ox-LDL組31.026±0.104*2.691±0.620*Sirt1干擾+ox-LDL組34.320±0.225*11.382±0.992*

3 討論

盡管血液中存在大量的抗氧化劑，但ox-LDL不僅可以在動脈粥樣硬化斑塊中被發現，而且在血漿或血清中也大量存在，因此ox-LDL被作為心血管疾病的血清學標志物[6]。我們分別用25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L ox-LDL刺激HCAEC，結果發現在200 mg/L ox-LDL的誘導下顯著降低了細胞的存活率，而100 mg/L ox-LDL能夠誘導HCAEC產生炎癥因子ICAM-1、IL-1、hs-CRP，并且沒有顯著影響細胞存活率。這與Zu F等人在ox-LDL誘導的微粒通過ICAM-1促進內皮單核細胞粘附的研究中相符[7]。因此我們選用100 mg/L ox-LDL刺激HCAEC，在體外建立AS細胞模型。

目前，Sirt1在脂肪組織炎癥中起著屏障作用，在抗炎過程中占有重要地位[8]。在本研究中，我們選用Sirt1基因過表達和干擾重組質粒，選擇毒性較小的脂質體轉染法介導Sirt1轉染于AS細胞模型，并通過質粒攜帶的EGFP綠色熒光標記及qRTPCR、Western blot實驗判斷Sirt1轉染效率。白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可以誘導人血管內皮細胞的各種炎癥功能，包括促凝血活性、粘附分子表達增加、白細胞募集和單核細胞趨化蛋白-1的產生[9]。高敏C反應蛋白（high sensitive C-reactive protein，hs-CRP）由于其對心血管疾病早期預測的靈敏性高而得名[10]。hs-CRP被認為在早期AS患者中顯著增加，并與疾病嚴重程度及其并發癥相關，因此常被作為AS的預測因子[11]。細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）是一種介導黏附反應的重要分子。Marzolla等人研究發現，內皮細胞鹽皮質激素受體可轉錄調控ICAM-1的表達促進由醛固酮誘導的動脈粥樣硬化[12]。因此，本實驗選用以上三種在AS的發生發展中具有代表性的炎癥因子作為研究對象探討Sirt1在HCAEC內發揮的抗炎作用。我們發現，Sirt1過表達能顯著抑制炎癥因子IL-1、hs-CRP及ICAM-1的表達，Sirt1干擾則顯著促進了炎癥因子IL-1、hs-CRP及ICAM-1的表達。因此我們認為Sirt1在體外AS模型細胞中發揮抗炎作用。

綜上所述，體外實驗結果表明Sirt1可能在HCAEC中抑制由ox-LDL誘導的炎癥反應，進而對人冠狀動脈內皮細胞起到保護作用。但其具體機制仍有待于我們的進一步研究。