p53、p16和Ki67在卵巢上皮性癌中的表達及其臨床病理意義

曹 琛，李時榮，徐曉艷

(1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059；2.內蒙古醫科大學附屬醫院病理科）

在婦科癌癥中，卵巢癌是導致死亡的首要原因，大多數婦女出現臨床癥狀就診已為卵巢癌晚期（國際婦科和產科聯合會[FIGO]第三階段），這在40~60歲中年婦女中很常見，因為其臨床缺乏特異性早期癥狀和成熟早期診斷方法，其發病率呈逐年升高和年輕化趨勢，因其通常在晚期確診，外科治療被放化療取代。五年存活率僅有29%[1]，其中卵巢上皮性腫瘤在卵巢惡性腫瘤中最為普遍。常見的卵巢上皮性癌組織類型有漿液性、粘液性、子宮內膜樣和透明細胞癌，其中漿液性癌最多見。研究新的診斷和預測指標以及早期治療，對我們臨床工作至關重要。p53是早期人類發現的抑癌基因，其發生突變在癌細胞中會預后不良。p16基因有調節細胞周期，抑制細胞增殖和分裂的功能。Ki67蛋白是一種與腫瘤細胞增殖有關的最具代表性的核抗原，有絲分裂與其功能密切相關。國內外均有對p53、p16和Ki67在卵巢上皮性癌中陽性表達的研究，但臨床特異性不高，且沒有對三者聯合表達的分析，因此本研究采用免疫組織化學方法檢測收集到標本的p53突變、p16和Ki67高表達情況，分析其與臨床病理特征的關系和三者之間的相關性及三者聯合診斷性能，探討三種基因在卵巢上皮性癌惡變過程中參與性及臨床意義，為卵巢上皮性癌的診斷和預后提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集保存于內蒙古醫科大學附屬醫院病理科2016-01~2018-12蠟塊標本，其中20例同時段因卵巢囊腫等原因接受治療的卵巢良性腫瘤組織，平均年齡43歲。60例卵巢上皮性癌，按組織分型有40例漿液性囊腺癌、8例黏液性囊腺癌、7例子宮內膜樣癌和5例透明細胞癌；按組織級別分有21例卵巢癌低級別和39例卵巢癌高級別；根據FIGO分級，34例歸為Ⅰ期/Ⅱ期、26例歸為Ⅲ/Ⅳ期。所有患者均確診并行手術治療，術前未接受過其他抗腫瘤治療，且組織標本采集均經患者及家屬知情同意，年齡25～69歲。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和儀器p53（MX008），p16（MX007）和Ki67（MX006）抗體工作液，EDTA抗原修復液，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均由福州邁新公司購得，以PBS代替一抗作空白對照，采用生物公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.2.2 p53，p16和Ki67的表達檢測 用免疫組化法檢測表達情況，通過經驗豐富病理醫生復查核實病理診斷與分級。搜集蠟塊標本進行4μm連續石蠟切片，置于粘附載玻片留作免疫組化，于75℃恒溫烤片機上烤片1h，二甲苯脫蠟，酒精梯度下行水化，按SP免疫組化試劑盒說明書操作，EDTA抗原修復液高溫修復5min，濕盒放于37℃恒溫箱孵育一抗，二抗，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸分化，反藍，酒精梯度上行脫水，二甲苯固定，封片，鏡下觀察。對p53、p16和Ki67表達與年齡，組織學類型，分級，FIGO分期的關系及其三者之間的相關性和聯合診斷性能進行分析。

1.3 結果判定

1.3.1 p53基因判定方法p53陽性表達定位于胞核，隨機在鏡下選取5個高倍視野（400*），根據陽性細胞所占比例及陽性表達顏色1）0分：陽性細胞小于5%，無色2）1分：陽性細胞在5%～25%淡黃色3）2分：陽性細胞在25-50%，淺棕色4）3分：陽性細胞在50%～75%，深棕色5）4分：陽性細胞大于75%。兩項乘積：≤4分野生型，高水平p53蛋白表達（>4分）和在卵巢癌中全陰性表達（0分，無義突變）作為突變型p53存在。

1.3.2 p16基因判定方法p16陽性表達為棕黃色，定位于胞質和胞核，鏡下高倍視野（400*）斑駁弱陽性染色為低表達，彌漫強陽性染色為高表達。

1.3.3 Ki67的蛋白判定方法Ki67陽性表達定位于胞核，為褐黃色，鏡下熱點區域的高倍視野（400*）按陽性細胞比例判定增值率，≤50%為低表達，>50%為高表達。

1.4 統計學處理

統計學分析使用SPSS 22.0統計軟件，采用χ2檢驗，Spearman等級相關方法對基因表達與臨床病理指標關系及基因表達相互關系進行相關性分析。利用雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05說明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 p53，p16和Ki67在不同卵巢組織的表達

卵巢癌組的p53突變率高于非卵巢癌組（見圖1B），兩類別的表達差異有統計學意義；在卵巢癌組中，p16和Ki67強陽性表達率明顯高于非卵巢癌組（見圖1C、D），表達差異有統計學意義（P<0.05）（見表1）。

2.2 p53、p16和Ki67在常見上皮性卵巢癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

p53、p16和Ki67在60例卵巢癌組織病患中的表達與年齡有顯著相關性（P<0.05）。年齡越大，p53突變率越高、p16和Ki67的高表達率也越高。漿液性癌中p53突變率70%（見圖1F），p16高表達率68%（見圖1G），Ki67的高表達率70%（見圖1H）；p53在粘液性癌突變率13%（見圖1J），p16高表達率13%（見圖1K），Ki67的高表達率13%（見圖1L）；子宮內膜癌p53突變率14%（見圖1N），p16高表達率43%（見圖1O），Ki67的高表達率57%（見圖1P）；透明細胞癌p53突變率20%（見圖1R），p16高表達率60%（見圖1S），Ki67的高表達率60%（見圖1T）。突變型p53表達多見于漿液性癌，p16彌漫陽性表達多見于漿液性癌和透明細胞癌，Ki67強陽性除粘液性癌基本在各類型上皮樣癌均多見，其表達與組織分型有顯著相關性（P<0.05）。Ⅰ～Ⅱ期p53突變率26%，p16強陽性率41%，Ki67的強陽性率44%；Ⅲ～Ⅳ期p53突變率85%，p16強陽性率77%，Ki67的強陽性率81%。組織級別和FIGO分期與它們的表達也密切相關（P<0.05），組織級別越高，分期越高，突變率高表達率越高（見表2）。

2.3 p53、p16和Ki67在卵巢上皮性癌組織中表達的相關性

在60例卵巢癌組織病例中，經相關分析p53突變與p16的高表達呈正相關（r=0.585，P=0.000<0.05）（見表3）；p53突變與Ki67高表達有顯著相關性且呈正相關（r=0.572，P=0.000<0.05）（見表4）；Ki67與p16的高表達有顯著性差異且呈正相關（r=0.590，P=0.000<0.05）（見表5）。

2.4 p53、p16和Ki67對卵巢上皮性癌診斷的性能

p53、p16和Ki67單項指標對卵巢上皮性癌診斷的靈敏度小于兩項指標聯合，兩項指標又小于三項指標聯合診斷靈敏度，且其中p53、p16和Ki67三項聯合靈敏度最高（0.72）（見表6）。

表1 在正常卵巢癌組織、卵巢癌組織中Ki67、p53和p16的表達Tab.1 Expression of Ki67,p53 and p16 in normal ovarian cancer tissues and ovarian cancer tissues

表2 p53、p16和Ki67在卵巢上皮性癌的表達與臨床病理特征的關系Tab.2 Expression of p53,p16 and Ki67 in epithelial ovarian carcinoma and their relationship with clinicopathological features

圖1 p53、p16及Ki67在各型上皮性卵巢癌中表達的免疫組織化學分析Fig.1 Immunohistochemical analysis of the expression of p53,p16 and Ki67 in epithelial ovarian carcinoma

表3 p53與p16在卵巢上皮性癌中表達的相關性Tab.3 Correlation between p53 and p16 expression in epithelial ovarian cancer

表4 Ki67與p53在卵巢上皮性癌中表達的相關性Tab.4 Correlation between Ki67 and p53 expression in epithelial ovarian cancer

表5 Ki67與p16在卵巢上皮性癌中表達的相關性Tab.5 Correlation between Ki67 and p16 expression in epithelial ovarian cancer

表6 p53、p16和Ki67對卵巢上皮性癌診斷的性能比較Tab.6 Comparison of p53,p16 and Ki67 in the diagnosis of epithelial ovarian cancer

3 討論

卵巢癌是一種女性高死亡率的惡性腫瘤。其中絕大部分是卵巢上皮性癌，容易廣泛轉移和頻繁復發，需要長期隨訪監測。大多數婦女是在晚期診斷出的。卵巢癌患者手術后最初對化療有反應，但僅限于早期患者，大多數患者會由于卵巢癌細胞對治療措施的抵抗性而復發，其無病間隔會逐漸縮短，而逐漸死于化療耐藥。卵巢上皮性癌患者5年生存率約為40%[2]。

p53基因（17p13）是人類癌癥中最重要的腫瘤抑制因子，編碼一種核轉錄因子，表達于DNA損傷、熱休克、缺氧和癌基因過度表達等各種應激信號。p53基因可分為野生型和突變型，野生型p53有腫瘤抑制作用，p53突變后，p53保持基因組的完整性和穩定性，調節細胞周期凋亡和促進DNA修復，如果DNA無法修復導致細胞凋亡[3]。p53基因在卵巢上皮性癌中會經常發生突變，無義突變則可能把p53基因完整地廢除掉，在鏡下表現為完全陰性。Gudkov A V等[4]發現野生型p53有促進免疫方面的內在作用，在癌癥發展中對慢性炎癥有積極影響。Agupitan A D等[5]發現突變型p53通過對癌癥的反應和炎癥反應，破壞天然腫瘤免疫并且能調節浸潤免疫細胞的活性，還可能影響凋亡后細胞的清除。Liu Z等[6]得出結果在某些情況下，突變型p 53可能是免疫治療反應性的有用生物標志物，可作為免疫治療的靶點來限制腫瘤生長和轉移，并可能與更好的生存預后有關。研究[7]表明卵巢上皮性癌的形成和患者預后不良與p53基因的缺失或突變密切相關。

p16基因，位于染色體9q21，又因其在細胞G1-S期轉變過程中發揮抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的作用被稱為細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A蛋白，很多研究表明p16可作為家族性黑色素瘤的特異性抗體，是一種在許多腫瘤中表現為下調的腫瘤抑制蛋白。參與調節細胞周期、衰老、凋亡、細胞侵襲和血管生成[8]。有學者研究p16在SKOV-3卵巢上皮性癌細胞和卵巢癌組織中表達有明顯降低。p16高表達可顯著抑制卵巢癌細胞的侵襲擴散能力[9]。高p16表達與卵巢癌患者的預后呈正相關。研究[10]表明p16基因在卵巢上皮性癌發生發展發揮作用，可作為預后指標。

Ki67基因位于10q25號染色體上，只編碼增殖細胞中存在的RNA產生蛋白質。Ki67是判斷腫瘤細胞活躍程度的重要指標，僅在細胞核陽性表達，與核糖體轉錄有關，是一種細胞核內的非組蛋白。其代表有絲分裂的指數，在循環細胞除G0靜息細胞外中均有表達。熱點區強的深棕色核染色被大多數作者推薦來進行Ki67計數。國內外研究表明Ki67高表達在多種腫瘤中出現，與腫瘤進展和預后相關。增殖活性的升高反應惡性行為。Chen M[11]等人研究證明Ki67在卵巢上皮性癌中不僅是一個預后因素，而且是一個生物標志物來預測治療結果。

為了更好地研究p53，p16和Ki67在常見卵巢上皮性癌的積極作用，本研究用p53突變率，p16和Ki67的高表達率來做結果判定。p53在卵巢上皮性癌中若陰若陽常表現為野生表達，只有彌漫強陽性和全陰性表達被認為是突變型p53。p16斑駁陽性和Ki67低表達對這四種常見卵巢上皮性癌的診斷意義不大。本研究結果表明，p53突變率、p16和Ki67高表達率在卵巢上皮性癌組織中明顯高于非卵巢組織，說明檢測這三種基因在判斷卵巢上皮性癌惡性程度上有一定意義。年齡與p53、p16和Ki67基因表達有關，年齡越大，突變率高表達率越高。在漿液性癌中，p53突變率、p16及Ki67強陽性率均高；粘液性癌中多見野生型p53、p16斑駁陽性和Ki67弱表達；子宮內膜樣癌中多見野生型p53、p16斑駁陽性和Ki67強陽性，透明細胞癌中多見野生型p53、p16彌漫陽性和Ki67強陽性。p53突變、p16和Ki67基因高表達與組織分級和臨床分期相關，分級越高，分期越晚，突變率強陽性率越高。鏡下觀察卵巢漿液性癌中有三例是從低級別向高級別轉化而來，可能與p53突變增多有關。p53與p16基因表達在卵巢上皮性癌中呈正相關，有研究[12]也表明在缺乏p53突變的晚期卵巢癌中，p16腫瘤抑制基因的表達缺失更為常見。同時分析Ki67與p53；Ki67與p16基因的表達在上皮性卵巢癌中的相關性差異有統計學意義，Ki67強陽性率越高，p53突變率或p16強陽性率也越高，表明抑癌基因的表達與細胞增殖活性有正相關性。計算p53、p16和Ki67對卵巢上皮性癌診斷的性能結果三者聯合靈敏度最高。這些結果表明上皮性卵巢癌的發生發展及浸潤轉移與p53突變率、p16和Ki67的高表達率顯著相關，與臨床病理指標的關系密切，對臨床診斷有很大積極意義。三者相互作用有關，聯合起來可作為卵巢癌患者的治療預測和診斷指標。