基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討自擬排石湯治療泌尿系結(jié)石的作用機(jī)制研究

趙子龍，楊 夏，高柏青＊

（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院藥學(xué)部，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最外常見的疾病之一，其發(fā)病原因與生活環(huán)境和飲食習(xí)慣密切相關(guān)，發(fā)病機(jī)制并未明確且研究數(shù)量不多，患者出現(xiàn)癥狀可見絞痛和放射性疼痛，如何做好泌尿系結(jié)石的防治工作已成為醫(yī)療界和全社會(huì)關(guān)注的問題[1]。泌尿系統(tǒng)結(jié)石在中醫(yī)領(lǐng)域?qū)佟傲茏C”范疇[2]。外感濕熱或穢濁之邪，或者嗜食肥甘厚膩，或者嗜酒，均能夠?qū)е聺駸醿?nèi)生，蘊(yùn)積于內(nèi)濕熱流注下焦，則尿液倍受熱灼煎熬，久而久之則誘發(fā)石淋之病?；蛘邿嶙苽j(luò)，迫血妄行導(dǎo)致血液外溢，繼而發(fā)生血淋。根據(jù)此病的發(fā)病機(jī)理，治療結(jié)石的藥物應(yīng)該具有以下三個(gè)要素：一為利尿通淋，促進(jìn)尿液排出量的增加，促使體內(nèi)產(chǎn)生自排壓力。二為清熱瀉火，盡早治療泌尿系炎癥，減輕炎癥導(dǎo)致的水腫及感染。三為行氣活血，解除輸尿管平滑肌和括約肌痙攣。三要素結(jié)合，能夠促使結(jié)石順利排出體內(nèi)。

將傳統(tǒng)中醫(yī)辨證施治理論作為基礎(chǔ)，針對(duì)泌尿系結(jié)石的病因病機(jī)，本院自制協(xié)定處方—排石湯，其組方按君，臣，佐，使的配伍原則，依據(jù)治療結(jié)石三要素精選藥物進(jìn)行配制而成。我院自擬的排石湯用于治療泌尿系結(jié)石具有較好的療效，方中由金錢草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草9味藥材組成。君藥金錢草味苦，酸，微寒。歸肝，膽，腎，膀胱經(jīng)，功能清熱解毒，利尿排石，活血散淤。臣藥海金砂性下降，善清小腸、膀胱濕熱，功專利尿通淋止痛，尤善止尿道疼痛，為治諸淋澀痛之要藥。臣藥王不留行具有利尿通淋功效，益母草具有利尿消腫，清熱解毒之功效[3]。此外，佐藥郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草等幾味藥材也都具有不同程度的利尿作用[4，5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥的相關(guān)研究，其整合生物電子信息數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)中藥復(fù)雜成分的作用靶點(diǎn)和代謝途徑進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在一定程度上可以節(jié)約時(shí)間、降低新藥研發(fā)成本并提高成功率。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探索排石湯治療泌尿系結(jié)石的作用機(jī)制，為后續(xù)的新藥開發(fā)及其機(jī)制驗(yàn)證提供理論支撐。

1 方法

1.1 排石湯的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)的檢索

使用中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN）（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索排石湯的9味組成藥材（金錢草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草）的成分和作用靶點(diǎn)，篩選Score cutoff>39且P<0.05的活性成分并進(jìn)行調(diào)控靶點(diǎn)的整理。

1.2 泌尿系結(jié)石疾病靶點(diǎn)的檢索

以“Urolithiasis”為關(guān)鍵詞在Genecards（https：//www.genecards.org/）及DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索泌尿系結(jié)石的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 篩選交集靶點(diǎn)和核心靶點(diǎn)

將排石湯的活性成分作用靶點(diǎn)與泌尿系結(jié)石疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集靶點(diǎn)的可視化分析，并將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//strin g-db.org/）中構(gòu)建PPI（protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）計(jì)算PPI相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，以網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)間隔度和自由度等參數(shù)大于均值為條件篩選核心靶點(diǎn)[6]。

1.4 GO和KEGG功能富集分析

將核心靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的富集分析，物種設(shè)定為人，基因名稱為官方名稱（official gene symbol），顯著性P<0.05，最后對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 分子對(duì)接

為進(jìn)一步驗(yàn)證活性成分與蛋白靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，應(yīng)用Autodock對(duì)“成分-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)中自由度顯著的成分進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的分子動(dòng)力學(xué)模擬，Pymol可視化化合物與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合模式。在PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中檢索蛋白靶點(diǎn)并獲得.pdb文件，應(yīng)用ChemDraw構(gòu)建小分子.mol結(jié)構(gòu)文件。對(duì)小分子和蛋白進(jìn)刪除配體分子和水分子、不完整殘基、多余蛋白質(zhì)構(gòu)象，并加氫和分配相關(guān)電荷等操作后進(jìn)行半柔性對(duì)接分析。結(jié)合能小于0kcal/mol表示可以自由結(jié)合[6]。

2 結(jié)果

2.1 排石湯活性化合物和靶點(diǎn)的整理

共檢索符合條件的活性成分124個(gè)，包括來(lái)自車前子的黃芩苷，來(lái)自丹參的丹參酮，來(lái)自甘草的甘草次酸等活性成分。對(duì)所有活性成分和作用靶點(diǎn)構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)（見圖1），黃色節(jié)點(diǎn)代表藥材，粉色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，青色節(jié)點(diǎn)代表活性成分作用的靶點(diǎn)。

圖1 藥材-成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 篩選交集靶點(diǎn)和核心靶點(diǎn)

整合Genecards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)搜集的泌尿系結(jié)石相關(guān)靶點(diǎn)，篩選泌尿系結(jié)石與復(fù)方的共有靶點(diǎn)140個(gè)。將共有靶點(diǎn)上傳至String進(jìn)行PPI分析，組織（Organism）設(shè)置為“Homo sapiens”。共有140個(gè)節(jié)點(diǎn)，998條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為14.3，預(yù)期的邊數(shù)：313，PPI富集p-value<1.0e-16，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表著各個(gè)靶點(diǎn)，線條代表著靶點(diǎn)之間的聯(lián)系（見圖2）。

圖2 交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用cytoscape計(jì)算String中PPI的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，以“間隔度”“自由度”值大于均值（175.18，14.57）為條件篩選出27個(gè)核心靶點(diǎn)，包括腫瘤壞死因子（TNF），前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（PTGS2），血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），立早基因（JUN），白細(xì)胞介素1β（IL-1B），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）等靶點(diǎn)。

2.3 GO和KEGG富集分析

將27個(gè)核心靶點(diǎn)上傳至String進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選P<0.05的分析結(jié)果，GO富集得出869條結(jié)果，其中生物過(guò)程（BP）790條，包括脂質(zhì)代謝過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過(guò)程的調(diào)控等；細(xì)胞組成（CC）18條，包括細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等；分子功能（MF）61條，包括信號(hào)受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、受體配體活性、抗氧化活性等。其中GO各條目顯著性前10的分析結(jié)果（見圖3）。

圖3 GO富集分析結(jié)果

KEGG通路富集相關(guān)通路103條，此部分列舉了顯著性前20的條目（見圖4）。由圖4可以看出復(fù)方可能作用于TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway），破骨細(xì)胞分化（osteoclast differentiation），腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system），Toll樣受體信號(hào)通路（toll-like receptor signaling pathway）等多條通路治療泌尿系結(jié)石。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果

2.4 核心成分-靶點(diǎn)的結(jié)合模式

整理“成分-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)中自由度TOP5的活性成分，借助分子對(duì)接技術(shù)對(duì)活性成分最相關(guān)的靶點(diǎn)AR（2PIU）和TNF（1OQE）進(jìn)行半柔性對(duì)接以探索它們互作的模式，最后進(jìn)行分析結(jié)果可視化（見圖5）。核心成分中不飽和脂肪酸類化合物的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)自由度較高，它們多數(shù)作用于核心靶點(diǎn)AR和TNF。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示Hexadecylic Acid、Lauric Acid、Myristic Acid和Stearic Acid與AR殘基ARG結(jié)合較好，Linolenic Acid與TNF的HIS16可以形成氫鍵，所有成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)結(jié)合能小于0，都可以自由結(jié)合，它們可能在排石湯治療泌尿系結(jié)石的生物學(xué)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

圖5 TO5核心成分與相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合模式

3 討論

泌尿系結(jié)石為泌尿系統(tǒng)常見疾病，可發(fā)生于腎、輸尿管、膀胱及尿道等任意部位，結(jié)石長(zhǎng)到5mm以上，可能會(huì)導(dǎo)致輸尿管阻塞，導(dǎo)致下背部或腹部嚴(yán)重疼痛，結(jié)石還可能導(dǎo)致尿血，嘔吐或排尿疼痛，大約有一半患有腎結(jié)石的人將在十年內(nèi)再患結(jié)石。許多危險(xiǎn)因素影響泌尿系結(jié)石的發(fā)生發(fā)展，飲食是重要因素之一，飲食中動(dòng)物蛋白，鈉，糖的高攝入量，以及過(guò)多攝入果汁可能會(huì)由于尿酸排泄量增加而增加泌尿系結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于泌尿系結(jié)石的生物學(xué)機(jī)制研究較少，洞悉其生物學(xué)機(jī)制有利于盡早實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。中醫(yī)藥秉持整體觀念和辨證論治的診治原則在疾病的預(yù)防、治療和保健方面發(fā)揮著重要的作用。此外，中藥及其天然產(chǎn)物是新藥發(fā)現(xiàn)的重要途經(jīng)和有力工具，較為經(jīng)典的抗瘧藥青蒿素，抗白血病藥物三氧化二砷，抗癌藥物紫杉醇都挖掘自中藥和天然產(chǎn)物。我院自制的排石湯由9種具備清熱解毒，利尿排石功效的藥材組成，在治療泌尿系結(jié)石方面具有很好的療效。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)了排石湯的潛在靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為后續(xù)排石湯的生物學(xué)機(jī)制和治療泌尿系結(jié)石的先導(dǎo)化合物的開發(fā)提供支撐。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)參數(shù)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)了排石湯排石湯中的薄荷酮，油酸，亞油酸，亞麻酸，硬脂酸，沒食子酸，姜黃素，異三葉素，丹參酮和丹參酚等核心化合物（見圖1）通過(guò)調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF），前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（PTGS2），血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），立早基因（JUN），白細(xì)胞介素1β（IL-1B），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）等27個(gè)核心靶點(diǎn)發(fā)揮治療泌尿系結(jié)石的作用，它們共同調(diào)節(jié)了TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway），破骨細(xì)胞分化（osteoclast differentiation），腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system），Toll樣受體信號(hào)通路（toll-like receptor signaling pathway）等多條通路（見圖4），它們是排石湯治療泌尿系結(jié)石的潛在作用機(jī)制。

據(jù)報(bào)道，晶胞相互作用是尿結(jié)石形成中最關(guān)鍵的步驟之一，高草酸尿癥誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡變化是這種相互作用的終點(diǎn)，重要的是TNF轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡這一進(jìn)程。草酸鈣是大多數(shù)尿結(jié)石的主要成分，高草酸尿癥是特發(fā)性腎結(jié)石的主要危險(xiǎn)因素之一，腎小管細(xì)胞在高水平的草酸鹽或草酸鈣晶體狀態(tài)下受到明顯損傷，這與氧化應(yīng)激的發(fā)展和活性氧（ROS）的過(guò)量生產(chǎn)有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)ROS主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和線粒體產(chǎn)生，并參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在暴露于高水平的草酸鹽或草酸鈣晶體期間，NADPH氧化酶已成為受體介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源。NADPH氧化酶的激活增加了ROS的生成，而ROS可以調(diào)節(jié)幾種與石頭有關(guān)的大分子的表達(dá)，從而促進(jìn)腎結(jié)石的形成[7～9]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)可能在高草酸尿大鼠的腎臟結(jié)晶和ROS產(chǎn)生中起重要作用[10～12]。本研究的KEGG富集分析結(jié)果顯示排石湯可以作用上述關(guān)鍵通路，它們可能是重要的治療途徑。此外，一項(xiàng)以大鼠為研究對(duì)象的Toll樣受體在腎結(jié)石引起的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的結(jié)果顯示受體的亞型發(fā)生變化，可能是泌尿系結(jié)石的標(biāo)識(shí)受體[13]。而本研究的結(jié)果顯示排石湯可會(huì)作用這一受體發(fā)揮藥理活性。另外，本研究的代謝通路富集分析結(jié)果顯示泌尿系結(jié)石的發(fā)生發(fā)展可能與典型的NF-kB信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路相關(guān)，其中IL1B，PTGS2，TNFSF11，TNF參與了NF-kB信號(hào)通路，IL1B，F(xiàn)GF2，JUN，INS，TNF參與了MAPK信號(hào)通路，Yusuf Ozlem Ilbey[14]等人通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述兩種經(jīng)典的信號(hào)通路可以誘導(dǎo)大鼠腎臟氧化應(yīng)激和結(jié)石形成，因?yàn)閜38-MAPK和NF-kB途徑在多種腎臟炎性疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜患せ?，包括抗腎小球基底膜腎炎，輸尿管阻塞，內(nèi)毒素血癥和免疫性復(fù)雜性腎炎。此外，作為MAPK的同工酶，p38-MAPK直接影響膠原蛋白的表達(dá)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)作，草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中，p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)了上皮細(xì)胞緊密連接的破壞，p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)[15]。重要的是，自擬排石湯的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)顯示可以調(diào)節(jié)NF-kB信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)治療泌尿系結(jié)石。應(yīng)用分子對(duì)接的策略對(duì)排石湯的關(guān)鍵成分和作用靶點(diǎn)的進(jìn)行了驗(yàn)證（見圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸類化學(xué)成分與AR和TNF的殘基可以自由結(jié)合，排石湯可能與它們作用產(chǎn)生治療作用。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)我院自擬排石湯治療泌尿系結(jié)石的分子機(jī)制，自擬排石湯通過(guò)調(diào)節(jié)TNF，PTGS2，JUN，IL-1B，AR等核心靶點(diǎn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)，Toll樣受體信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路，NF-kB和MAPK等核心通路治療泌尿系結(jié)石。由于數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇以及更新的差異，研究結(jié)果可能存在不足，更多的機(jī)制需要后續(xù)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。

4 展望

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析方法發(fā)現(xiàn)了排石湯治療泌尿系結(jié)石的潛在分子機(jī)制，多靶點(diǎn)-多途徑的治療特點(diǎn)與中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念不謀而合，排石湯通過(guò)調(diào)控與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)的靶點(diǎn)和通路發(fā)揮治療作用。中醫(yī)藥對(duì)于醫(yī)藥健康領(lǐng)域一個(gè)偉大的寶庫(kù)，需要更好的開發(fā)和利用，相信借助現(xiàn)代分析技術(shù)使得更多人們科學(xué)認(rèn)知中醫(yī)藥，受益于中醫(yī)藥。