基于網絡藥理學和分子對接探討自擬排石湯治療泌尿系結石的作用機制研究

趙子龍，楊 夏，高柏青＊

（內蒙古包鋼醫院藥學部，內蒙古 包頭 014010）

泌尿系結石是泌尿外科最外常見的疾病之一，其發病原因與生活環境和飲食習慣密切相關，發病機制并未明確且研究數量不多，患者出現癥狀可見絞痛和放射性疼痛，如何做好泌尿系結石的防治工作已成為醫療界和全社會關注的問題[1]。泌尿系統結石在中醫領域屬“淋證”范疇[2]。外感濕熱或穢濁之邪，或者嗜食肥甘厚膩，或者嗜酒，均能夠導致濕熱內生，蘊積于內濕熱流注下焦，則尿液倍受熱灼煎熬，久而久之則誘發石淋之病。或者熱灼傷血絡，迫血妄行導致血液外溢，繼而發生血淋。根據此病的發病機理，治療結石的藥物應該具有以下三個要素：一為利尿通淋，促進尿液排出量的增加，促使體內產生自排壓力。二為清熱瀉火，盡早治療泌尿系炎癥，減輕炎癥導致的水腫及感染。三為行氣活血，解除輸尿管平滑肌和括約肌痙攣。三要素結合，能夠促使結石順利排出體內。

將傳統中醫辨證施治理論作為基礎，針對泌尿系結石的病因病機，本院自制協定處方—排石湯，其組方按君，臣，佐，使的配伍原則，依據治療結石三要素精選藥物進行配制而成。我院自擬的排石湯用于治療泌尿系結石具有較好的療效，方中由金錢草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草9味藥材組成。君藥金錢草味苦，酸，微寒。歸肝，膽，腎，膀胱經，功能清熱解毒，利尿排石，活血散淤。臣藥海金砂性下降，善清小腸、膀胱濕熱，功專利尿通淋止痛，尤善止尿道疼痛，為治諸淋澀痛之要藥。臣藥王不留行具有利尿通淋功效，益母草具有利尿消腫，清熱解毒之功效[3]。此外，佐藥郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草等幾味藥材也都具有不同程度的利尿作用[4，5]。網絡藥理學研究策略廣泛應用于中醫藥的相關研究，其整合生物電子信息數據庫數據對中藥復雜成分的作用靶點和代謝途徑進行分析和預測，利用網絡藥理學方法在一定程度上可以節約時間、降低新藥研發成本并提高成功率。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法探索排石湯治療泌尿系結石的作用機制，為后續的新藥開發及其機制驗證提供理論支撐。

1 方法

1.1 排石湯的化學成分和作用靶點的檢索

使用中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN）（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索排石湯的9味組成藥材（金錢草、海金砂、王不留行、益母草、郁金、車前子、丹參、懷膝、生甘草）的成分和作用靶點，篩選Score cutoff>39且P<0.05的活性成分并進行調控靶點的整理。

1.2 泌尿系結石疾病靶點的檢索

以“Urolithiasis”為關鍵詞在Genecards（https：//www.genecards.org/）及DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）數據庫搜索泌尿系結石的相關靶點。

1.3 篩選交集靶點和核心靶點

將排石湯的活性成分作用靶點與泌尿系結石疾病相關靶點進行交集靶點的可視化分析，并將靶點數據上傳至String數據庫（https：//strin g-db.org/）中構建PPI（protein-protein interaction）網絡。利用Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）計算PPI相關網絡參數，以網絡中節點間隔度和自由度等參數大于均值為條件篩選核心靶點[6]。

1.4 GO和KEGG功能富集分析

將核心靶點上傳至String數據庫進行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的富集分析，物種設定為人，基因名稱為官方名稱（official gene symbol），顯著性P<0.05，最后對分析結果進行可視化。

1.5 分子對接

為進一步驗證活性成分與蛋白靶點之間的結合活性，應用Autodock對“成分-靶點”作用網絡中自由度顯著的成分進行相關靶點的分子動力學模擬，Pymol可視化化合物與對應靶點蛋白的結合模式。在PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中檢索蛋白靶點并獲得.pdb文件，應用ChemDraw構建小分子.mol結構文件。對小分子和蛋白進刪除配體分子和水分子、不完整殘基、多余蛋白質構象，并加氫和分配相關電荷等操作后進行半柔性對接分析。結合能小于0kcal/mol表示可以自由結合[6]。

2 結果

2.1 排石湯活性化合物和靶點的整理

共檢索符合條件的活性成分124個，包括來自車前子的黃芩苷，來自丹參的丹參酮，來自甘草的甘草次酸等活性成分。對所有活性成分和作用靶點構建“藥材-成分-靶點”作用網絡（見圖1），黃色節點代表藥材，粉色節點代表活性成分，青色節點代表活性成分作用的靶點。

圖1 藥材-成分-靶點作用網絡

2.2 篩選交集靶點和核心靶點

整合Genecards、DisGeNET數據庫搜集的泌尿系結石相關靶點，篩選泌尿系結石與復方的共有靶點140個。將共有靶點上傳至String進行PPI分析，組織（Organism）設置為“Homo sapiens”。共有140個節點，998條邊，平均節點度值為14.3，預期的邊數：313，PPI富集p-value<1.0e-16，網絡節點代表著各個靶點，線條代表著靶點之間的聯系（見圖2）。

圖2 交集靶點的蛋白互作網絡

利用cytoscape計算String中PPI的網絡參數，以“間隔度”“自由度”值大于均值（175.18，14.57）為條件篩選出27個核心靶點，包括腫瘤壞死因子（TNF），前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2），血管緊張素轉化酶（ACE），立早基因（JUN），白細胞介素1β（IL-1B），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）等靶點。

2.3 GO和KEGG富集分析

將27個核心靶點上傳至String進行GO和KEGG富集分析，篩選P<0.05的分析結果，GO富集得出869條結果，其中生物過程（BP）790條，包括脂質代謝過程的正調控、對內源性刺激的反應、對激素的反應、多細胞生物過程的調控等；細胞組成（CC）18條，包括細胞外空間、細胞外區域、細胞質、內質網腔等；分子功能（MF）61條，包括信號受體結合、蛋白質結合、受體配體活性、抗氧化活性等。其中GO各條目顯著性前10的分析結果（見圖3）。

圖3 GO富集分析結果

KEGG通路富集相關通路103條，此部分列舉了顯著性前20的條目（見圖4）。由圖4可以看出復方可能作用于TNF信號通路（TNF signaling pathway），破骨細胞分化（osteoclast differentiation），腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system），Toll樣受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway）等多條通路治療泌尿系結石。

圖4 KEGG富集分析結果

2.4 核心成分-靶點的結合模式

整理“成分-靶點”作用網絡中自由度TOP5的活性成分，借助分子對接技術對活性成分最相關的靶點AR（2PIU）和TNF（1OQE）進行半柔性對接以探索它們互作的模式，最后進行分析結果可視化（見圖5）。核心成分中不飽和脂肪酸類化合物的網絡參數自由度較高，它們多數作用于核心靶點AR和TNF。分子動力學模擬結果顯示Hexadecylic Acid、Lauric Acid、Myristic Acid和Stearic Acid與AR殘基ARG結合較好，Linolenic Acid與TNF的HIS16可以形成氫鍵，所有成分與對應的靶點結合能小于0，都可以自由結合，它們可能在排石湯治療泌尿系結石的生物學機制中發揮重要的作用。

圖5 TO5核心成分與相關靶點的結合模式

3 討論

泌尿系結石為泌尿系統常見疾病，可發生于腎、輸尿管、膀胱及尿道等任意部位，結石長到5mm以上，可能會導致輸尿管阻塞，導致下背部或腹部嚴重疼痛，結石還可能導致尿血，嘔吐或排尿疼痛，大約有一半患有腎結石的人將在十年內再患結石。許多危險因素影響泌尿系結石的發生發展，飲食是重要因素之一，飲食中動物蛋白，鈉，糖的高攝入量，以及過多攝入果汁可能會由于尿酸排泄量增加而增加泌尿系結石形成的風險。目前，關于泌尿系結石的生物學機制研究較少，洞悉其生物學機制有利于盡早實現精準治療。中醫藥秉持整體觀念和辨證論治的診治原則在疾病的預防、治療和保健方面發揮著重要的作用。此外，中藥及其天然產物是新藥發現的重要途經和有力工具，較為經典的抗瘧藥青蒿素，抗白血病藥物三氧化二砷，抗癌藥物紫杉醇都挖掘自中藥和天然產物。我院自制的排石湯由9種具備清熱解毒，利尿排石功效的藥材組成，在治療泌尿系結石方面具有很好的療效。

本研究借助網絡藥理學的方法預測了排石湯的潛在靶點和相關通路，為后續排石湯的生物學機制和治療泌尿系結石的先導化合物的開發提供支撐。通過網絡藥理學的相關參數計算，發現了排石湯排石湯中的薄荷酮，油酸，亞油酸，亞麻酸，硬脂酸，沒食子酸，姜黃素，異三葉素，丹參酮和丹參酚等核心化合物（見圖1）通過調控腫瘤壞死因子（TNF），前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2），血管緊張素轉化酶（ACE），立早基因（JUN），白細胞介素1β（IL-1B），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）等27個核心靶點發揮治療泌尿系結石的作用，它們共同調節了TNF信號通路（TNF signaling pathway），破骨細胞分化（osteoclast differentiation），腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system），Toll樣受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway）等多條通路（見圖4），它們是排石湯治療泌尿系結石的潛在作用機制。

據報道，晶胞相互作用是尿結石形成中最關鍵的步驟之一，高草酸尿癥誘導的腎小管上皮細胞凋亡變化是這種相互作用的終點，重要的是TNF轉導途徑可以促進腎小管細胞凋亡這一進程。草酸鈣是大多數尿結石的主要成分，高草酸尿癥是特發性腎結石的主要危險因素之一，腎小管細胞在高水平的草酸鹽或草酸鈣晶體狀態下受到明顯損傷，這與氧化應激的發展和活性氧（ROS）的過量生產有關，細胞內ROS主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和線粒體產生，并參與多種信號傳導途徑。在暴露于高水平的草酸鹽或草酸鈣晶體期間，NADPH氧化酶已成為受體介導的ROS產生的主要來源。NADPH氧化酶的激活增加了ROS的生成，而ROS可以調節幾種與石頭有關的大分子的表達，從而促進腎結石的形成[7～9]。腎素-血管緊張素系統可能在高草酸尿大鼠的腎臟結晶和ROS產生中起重要作用[10～12]。本研究的KEGG富集分析結果顯示排石湯可以作用上述關鍵通路，它們可能是重要的治療途徑。此外，一項以大鼠為研究對象的Toll樣受體在腎結石引起的繼發性炎癥反應的結果顯示受體的亞型發生變化，可能是泌尿系結石的標識受體[13]。而本研究的結果顯示排石湯可會作用這一受體發揮藥理活性。另外，本研究的代謝通路富集分析結果顯示泌尿系結石的發生發展可能與典型的NF-kB信號通路和MAPK信號通路相關，其中IL1B，PTGS2，TNFSF11，TNF參與了NF-kB信號通路，IL1B，FGF2，JUN，INS，TNF參與了MAPK信號通路，Yusuf Ozlem Ilbey[14]等人通過大鼠實驗發現上述兩種經典的信號通路可以誘導大鼠腎臟氧化應激和結石形成，因為p38-MAPK和NF-kB途徑在多種腎臟炎性疾病實驗模型中被激活，包括抗腎小球基底膜腎炎，輸尿管阻塞，內毒素血癥和免疫性復雜性腎炎。此外，作為MAPK的同工酶，p38-MAPK直接影響膠原蛋白的表達參與了動脈粥樣硬化的發作，草酸鈣結石形成過程中，p38 MAPK信號通路介導了上皮細胞緊密連接的破壞，p38 MAPK信號通路相關蛋白的表達水平上調[15]。重要的是，自擬排石湯的網絡藥理學預測顯示可以調節NF-kB信號通路和MAPK信號通路，可能通過調節氧化應激反應治療泌尿系結石。應用分子對接的策略對排石湯的關鍵成分和作用靶點的進行了驗證（見圖5），結果發現脂肪酸類化學成分與AR和TNF的殘基可以自由結合，排石湯可能與它們作用產生治療作用。本研究應用網絡藥理學和分子對接技術預測我院自擬排石湯治療泌尿系結石的分子機制，自擬排石湯通過調節TNF，PTGS2，JUN，IL-1B，AR等核心靶點，腎素血管緊張素系統，Toll樣受體信號通路，TNF信號通路，NF-kB和MAPK等核心通路治療泌尿系結石。由于數據庫的選擇以及更新的差異，研究結果可能存在不足，更多的機制需要后續的生物學實驗的設計和驗證。

4 展望

綜上所述，應用網絡藥理學和分子對接分析方法發現了排石湯治療泌尿系結石的潛在分子機制，多靶點-多途徑的治療特點與中醫藥治療疾病的整體觀念不謀而合，排石湯通過調控與炎癥反應和氧化應激密切相關的靶點和通路發揮治療作用。中醫藥對于醫藥健康領域一個偉大的寶庫，需要更好的開發和利用，相信借助現代分析技術使得更多人們科學認知中醫藥，受益于中醫藥。