基于網絡藥理學探討復方蓯蓉益智膠囊治療阿爾茨海默病的機制研究

姚鳳紅，楊福生，苗 陽

（1.北京市中關村醫院神經內科，北京100190；2.北京市中關村醫院醫務科；3.中國中醫科學院西苑醫院心內科）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中引起癡呆最常見的疾病，臨床上表現為近期記憶的減退，常常伴有行為、定向力和判斷等多種功能障礙，且進行性加重，晚期會影響日常生活功能，出現嚴重的失能及失智。主要病理改變為大腦皮質和海馬等處的以β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）為核心的細胞外老年斑（senile plaques，SP）和以異常磷酸化的Tau蛋白為核心的細胞內神經元纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT），同時還伴有神經元和突觸的丟失等[1]。根據國際AD協會報道，預計到2050年全球AD患者將達到1.15億[2]。

目前臨床上治療AD的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、腦-腸軸調節的國產新藥甘露特納、Ca2+通道抑制劑及石杉堿甲。石杉堿甲作為我國的傳統藥物，近年來中藥成分的研究取得了顯著的成效，在治療阿爾茨海默病方面發揮著越來越重要的作用。復方蓯蓉益智膠囊是王永炎院士通過多年臨床實踐基礎上研發的，在北京、天津等多家醫院對AD患者治療后發現該中成藥能夠改患者[3～5]認知功能。

本研究采用網絡藥理學的活性成分-作用靶點-通路-疾病網絡研究思路，探討復方蓯蓉益智膠囊核心組分與AD之間可能存在的相互關系，進一步闡明該中成藥抗阿爾茨海默病的作用機制。

1 資料與方法

1.1 復方蓯蓉益智膠囊主要化學成分的獲取

從中藥系統藥理學數據庫[5（]TCMSP，http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索復方蓯蓉益智膠囊的中藥成分，該數據庫可獲得荷葉、肉蓯蓉和漏蘆這3種藥物的成分信息，其中制何首烏從已經發表的CNKI文獻[6]和碩博士畢業論文數據庫[7]中查詢其主要的化學成分。地龍屬于動物類藥，由于其為異源蛋白，本研究舍棄了此種藥物成分的分析。

1.2 化學成分潛在作用靶標庫的構建

荷葉、肉蓯蓉和漏蘆使用TCMSP數據庫查詢其主要的化學成分，通過口服生物利用度（oral bioavailabily，OB）≥30和類藥性（drug-like，DL）≥0.18進行篩選，納入進一步研究。制首烏的化學成分從文獻中獲得后，利用Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、化源網（https：//www.chemsrc.com/）等數據庫獲得化學成分數據。大部分候選化合物的靶點可通過TCMSP檢索到，部分該庫沒有的靶點信息，利用化合物的SMILES作為檢索詞，通過SwissTargetPredictiong數 據 庫（http：//swisstargetprediction.ch/）預測靶點信息。獲得以上4種藥物的所有靶點信息后，去除掉所有的重復項，利用最新版Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/），將所用的靶蛋白名稱轉化為相應的標準基因名，個別找不到對應的條目去除掉。

1.3 疾病相關靶點庫的建立

疾病相關靶點通過關鍵詞“Alzheimer”在OMIM數 據 庫（Online Mendelian Inheritance in Man?，https：//www.omim.org/）進行獲取。

1.4 靶點通路注釋分析

成分潛在靶點庫和AD疾病庫中的靶點之間進行比對，獲得化合物-靶基因-AD疾病之間的共同靶點（交集基因）。蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建：共同靶點輸入STRING數據庫（https：//string-db.org/），以“homo sapiens”作為唯一篩選參數，其余使用數據中的默認值進行獲取，得到蛋白的相互作用結果。輸出文件使用CytoscapeV 3.7.2對STRING的PPI進行分析。交集基因導入Metascape數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html）進行GO富集分析（gene ontology，GO）和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 活性成分篩選

TCMSP數據庫獲得荷葉的組分包含化合物為93個，肉蓯蓉為75個，漏蘆為25個，共193個，按照參數OB≥30%和DL≥0.18篩選，得24個化合物。制何首烏文獻中獲得10個化合物，一共入組34個化合物（見表1）。

2.2 活性成分的潛在靶標和疾病相關靶基因

通過TCMSP和SwissTargetPredictiong數據庫獲得了以上34種活性化合物的潛在靶標843個，經過去重復處理后的得到了438個靶標信息。對他們進行Uniprot數據，獲得靶蛋白名稱和對應基因名信息，最終得到425個靶標結果。OMIM數據庫中獲得與AD相關的靶基因182個。兩個結果比對取之間的交集后，最終獲得了23個交集基因（見表2）。

表1 復方蓯蓉益智膠囊中4種藥物的主要化學成分

表2 活性成分-疾病相關靶標信息

2.3 蛋白質相互作用的注釋

STRING數據庫中構建蛋白質相互作用PPI網絡，共獲得58個連接，平均節點度是5.04，PPI富集p值是7.12e-13。Cytoscape處理后的結果見圖1。其中每個節點（node）代表的蛋白，圖中圓圈部分，連接度（degree）大小以不同顏色和大小的node顯示。節點與節點之間的連接（edge）代表兩個蛋白之間的相互作用，combined score值的大小以線條粗細來凸顯出。其中依據連接度排名前5的基因為TNF（12），IL1B（11），VEGFA（11），CASP3（11）和NOS3（9）。

圖1 復方蓯蓉益智膠囊主要化學成分蛋白質相互作用網絡圖

2.4 作用通路注釋分析

Metascape數據庫中共得到667個GO富集分析和KEGG通路富集分析結果，依據默認的參數進行篩選，最終排名前20位的通路注釋結果見圖2。依次為調節神經遞質水平、AGE-RAGE信號通路（KEGG）、調節化學突觸傳遞、調節解剖結構的大小、對有毒物質的反應、激素水平調節、體外凋亡信號通路、突觸傳遞的負調控、淀粉樣前體蛋白代謝過程等。

圖2 排名前20名的GO和KEGG通路富集分析

3 討論

關于AD的發病機制，國際上提出眾多的假說，得到認可的主要有β淀粉樣蛋白（Beta amyloid protein，Aβ）異常沉積、tau蛋白的過度磷酸化、氧化應激、細胞凋亡以及腸道菌群失調等[8]。本研究通過TCMSP數據庫發現復方蓯蓉益智囊主要活性成分34個，分別是：二苯乙烯苷類、蒽醌類及卵磷脂、環烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿、槲皮素等。這些有效化學成分存在一對多、一對一及多對一作用特點。證實了復方蓯蓉益智膠囊確實具有多成分，多靶點協同的特性。檢索阿爾茨海默病的相關基因，與復方蓯蓉益智膠囊活性成分作用靶交集，得到23個交集基因，包括IL10、IL1B、CASP8、CASP3、TNF、VEGFA、CAV1、NOS3等，分別作用于神經元細胞外淀粉樣前體蛋白（amyloid precusor protein，APP）的形成、氧化應激、神經遞質調節以及凋亡等神經元損傷通路。依據連接度排名前5的基因分別為TNF、IL1B、VEGFA、CASP3和NOS3，主要參與調節神經遞質水平、AGE-RAGE信號通路（KEGG）等。

在AD患者的腦內，β-淀粉樣蛋白在細胞外大量聚集形成老年斑。在高糖狀態及老年體內糖基化終產物（advaneed glycation end products，AGEs）及晚期糖化終產物受體（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）也明顯增加。近年來許多研究表明，AGEs的存在與AD、糖尿病關系密切[9～12]。Aβ的不斷增加，一方面通過RAGE下游信號通路激活氧化應激、炎癥反應等損傷途徑，激活小膠質細胞和星形膠質細胞釋放出炎癥介質，如IL-1β[13]、IL-6、IL-18、TNF-α[14]等，引起局部的炎癥反應；另一方面，Aβ-RAGE相互作用還能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），引起RAGE表達增加，從而激活Aβ介導的正反饋損傷效應，加重Aβ毒性效應[15]，最終加劇Aβ的沉積和老年斑的形成，進而形成惡性循環。通過PPI分析，推測復方蓯蓉益智膠囊主要活性成分可能會降低RAGE表達、阻斷RAGE與Aβ結合的信號通路從而減輕AD患者炎性反應損傷。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種低氧誘導的分泌性蛋白質，是調節血管功能的主要細胞因子，與內皮細胞表面受體酪氨酸激酶結合促進血管生成并參與血管重建；也可直接作用于神經元，起到營養神經和保護腦神經元的作用；VEGF亦參與內源性膽堿系統通路，在阿爾茨海默病等神經變性病和腦血管病中起關鍵作用。CASP3全稱caspase3，是細胞凋亡的主要執行者。通過特異性地裂解DNA依賴性蛋白激酶等，改變其結構而導致細胞凋亡。Caspase3不僅在腦內海馬區和皮層神經元的凋亡過程中發揮效應器的作用，而且還直接作用于阿爾茨海默病形成相關的APP等。中樞神經系統的NOS至少有三型包括神經元型（nNOS或NOSI），誘導型（iNOS）和內皮型（eNOS或NOS3），前兩種具有毒性作用，而來源于eNOS的NO具有神經保護作用。上述研究結果提示復方蓯蓉益智膠囊可能通過參與血管重建、細胞凋亡來發揮神經保護作用，延緩AD病情進展。

本研究基于網絡藥理學和信息工程學技術手段，建立復方蓯蓉益智膠囊活性成分-靶標-阿爾茨海默病-信號通路分子生物網絡，探究復方蓯蓉益智膠囊治療AD的潛在機制，發現復方蓯蓉益智膠囊通過參與細胞氧化應激、細胞保護、調節腦血供等途徑發揮延緩AD不可逆的病理進展，為后續分子機制研究和實驗設計提供理論依據。