蒙古族不同齲敏感兒童變形鏈球菌產酸耐酸及耐酸因子遺傳多態性研究

繆 羽，王昭君，祁安舒

（1.內蒙古醫科大學第四附屬醫院口腔科，內蒙古 包頭 014030；2.河北經貿大學金融學院）

變形鏈球菌（S.mutans）作為主要的致齲菌，通過粘附、產酸、耐酸等作用導致牙體硬組織脫礦與再礦化的失衡[1～3]。菌細胞經糖酵解產生乳酸后口腔pH值降低，釉質崩解脫落脫礦，形成齲齒；同時為了適應低pH值的口腔環境，菌細胞通過酸適應性或耐酸性維持一個相對中性的胞內環境得以長期生存[4～6]。乳牙齲病發生與地域、民族、生活習慣均有相關性[7，8]，蒙古族遺傳多態性及生活飲食方式對齲病的影響可能存在不確定性。本課題通過蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌的致齲過程分析，為區域蒙古族齲病防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象及樣本收集

受試者選取2015-09~2015-12包頭市蒙古族幼兒園3~5歲70名的蒙古族兒童（高齲40名，無齲30名）。使用CPI探針在自然光條件下收集上述兒童牙菌斑，無齲兒童選取頰側面菌斑，高齲兒童取齲病損區的菌斑。受試兒童取樣前一天晚上不刷牙漱口，第二天早晨不進食喝水，所取牙菌斑置于含硫乙醇鹽轉送液的EP管中，上端加液體石蠟密封，冰浴下轉送到-20℃的冰箱保存。所有受檢兒童均家長同意，并簽知情同意書。

1.2 診斷標準

點隙窩溝或光滑面有明顯齲洞、釉質下破壞、可探及底部發軟或洞壁的病損為齲。以齲失補牙數（decayed missing filled teeth，dmft）作為高齲和無齲判定標準，dmft≥5為高齲組，dmft=0為無齲組[9]。

1.3 納入及排除標準

（1）納入標準：①出生于內蒙古包頭地區的蒙古族（三代內無與其他民族婚配）；②3~5歲的兒童，乳牙已經全部萌出、未發生脫落，無恒牙早萌現象；③齲壞牙齒未進行充填等治療；④未戴牙齒矯正器者；⑤檢查前一個小時未進食，能夠配合取樣；（2）排除標準：①口腔有除齲病以外其他嚴重感染病灶；②有全身系統性疾病和（或）家族遺傳性疾病；③因其他疾病近3個月內服用過抗生素等藥物。

1.4 實驗菌株

40例高齲兒童和30例無齲兒童牙菌斑，經過培養，形態學、生化反應、16sDNA鑒定，共獲得40株變形鏈球菌臨床分離株（21株來自高齲者，19株來自無齲者），國際參考菌株ATCC 25175（廣東省微生物菌種保藏中心）。

1.5 實驗方法

1.5.1 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株產酸、耐酸能力測定以0.5為間隔配制含5%蔗糖pH值為7.0~4.0的BHI培養基。取國際標準株和臨床分離株菌懸液，按照菌液與液體培養基1：10（v/v）比例接種細菌，37℃厭氧袋內培養48h，3000r/min離心15min，收集上清液體，精密酸度計測定上清液體的終末pH值，每個pH值測三次，取平均值，計算pH值變化值△pH值（初始pH值-終末pH值）即產酸能力。同樣條件下，收集培養基內的細菌，用4mL無菌生理鹽水稀釋震蕩混勻，紫光分光光度計測定540nm處的吸光度A值即耐酸能力。

1.5.2 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株DNA提取經形態學鑒定的高齲組、無齲組變形鏈球菌臨床分離株接種于選擇培養基上，厭氧袋內培養48h，挑取單個菌落于10mL BHI培養基內增菌，細菌DNA提取試劑盒提取和純度檢測：提取DNA的A260/280比值在1.7~2.0之間，沒有蛋白質和酚的污染，-20℃冰箱保存。

1.5.3 PCR反應和uncD擴增依次混勻并離心下列試劑：（1）1μL上游引物（引物1）；（2）1μL下游引物（引物2）；（3）2μL模板DNA；（4）25μL PCRmix；（5）21μL H2O。

uncD擴增：充分擴增PCR反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物結果，凝膠成像系統分析，凝膠DNA回收試劑盒回收產物，-20℃冰箱保存。

1.5.4 蒙古族兒童變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因的RFLP分析uncD選擇限制性內切酶是AluI和HinfI。按照酶切條件：37℃恒溫水浴中孵育18h，酶切產物行3%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5.5 DNA測序40株蒙古族兒童高齲、無齲變形鏈球菌臨床分離株與變形鏈球菌標準菌株進行細菌基因組DNA提取和PCR產物擴增，16SrDNA鑒定，測序結果在EZTaxon數據庫進行Identify比對，利用MEGA軟件構建菌株系統進化樹。

2 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件統計分析，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌在pH值7.0~4.0條件下，高齲組和無齲組變形鏈球菌產酸和耐酸能力比較，以、采用獨立樣本t檢驗分析處理（檢驗水準α=0.05，P＜0.05差別有統計學意義）。采用確切概率法分析處理蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因分型（P＜0.05為差別有統計學意義）。

3 結果

3.1 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株產酸能力比較

蒙古族兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株的產酸能力隨著pH值升高而升高；同一pH值條件下，高齲組產酸能力高于無齲組；pH值為7~6、4~4.5時，高齲組和無齲組的產酸能力差別尚無統計學意義（P>0.05）；pH值為5.0~5.5時，高齲組與無齲組比較差別有統計學意義（P<0.05）（見表1）。

表1 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的產酸能力(x±s)

3.2 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株耐酸能力比較

隨著pH值降低，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離菌株的生長受到抑制；同一pH值，無齲組菌株的生長抑制更明顯；pH值4.5條件下，高齲組與無齲組菌株的耐酸性比較差別有統計學意義（P<0.05），其他pH環境中，兩組間比較差別尚無統計學意義（P>0.05）（見表2）。

3.3 DNA測序結果

序列拼接后片段長度1336bp，結果如下：

表2 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的生長情況(±s)

表2 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的生長情況(±s)

pH值 吸光度A值P值高齲組（n=21） 無齲組（n=19）71.49263±0.0449391.40638±0.0648900.293 6.51.25738±0.0394551.21975±0.0655170.630 61.22225±0.0511611.22063±0.517440.982 5.50.89238±0.0593540.85863±0.0635890.704 50.51988±0.0645430.50413±0.0519710.852 4.50.24913±0.0131450.19850±0.0109560.010 40.16363±0.0104160.16213±0.0092670.916

3.4 樣品的比對和菌株進化

圖1 樣品在EZTaxon數據庫上Identify

EZTaxon數據庫上進行Identify比對結果顯示樣品的序列與變形鏈球菌（S.mutans）的序列同源性很高，相似度高達100%。

圖2 菌株系統進化樹

蒙古族兒童高齲組和無齲組變形鏈球菌臨床分離株經blast比對和進化樹分析，可確定樣品中的細菌為變形鏈球菌（S.mutans），測序成功。

3.5 變形鏈球菌耐酸因子F-ATP酶的亞基uncD基因分析

以DNA為模板，特異引物擴增基因uncD，約1.3Kb，相對分子質量與引物相同，擴增條帶亮度較高，無一雜帶，說明特異性較高（見圖3）。

圖3 變形鏈球菌臨床株F-ATPase亞基uncD基因擴增

通過對蒙古族不同齲敏感兒童變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD的AluI-RFLP分析，表現為A和B兩種基因型，且不同耐酸菌株中分布不同，差異有統計學意義（P<0.05），高齲組菌株B型居多，無齲組菌株A型居多（見表3）。

表3 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因型分布

4 討論

齲病貫穿于整個生命周期，乳牙齲病的發生發展使兒童的身心健康生長發育受到嚴重威脅。繆羽等調查[10]包頭市3~5歲兒童患齲率65.7%，充填率僅2.3%，乳牙齲病形勢不容樂觀。本實驗對內蒙古包頭地區3~5歲蒙古族高齲、無齲兒童口腔變形鏈球菌初步分析，認為蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株在pH值7.0~4.0的BHI液體培養基中生長態勢良好，隨pH值升高產酸能力升高，同時菌株生長受到抑制，耐酸能力影響不一。同一pH值條件下，高齲組產酸能力、耐酸能力均高于無齲組，無齲組菌株生長抑制更明顯；說明高齲組中變形鏈球菌數量多，齲病敏感性不同，產酸效果與齲病嚴重性相關，致齲性強。薛晶等人對不同齲敏感人群牙菌斑中變形鏈球菌群的分布的研究發現，高齲兒童檢出率中位居前列，高達93.3%，無齲組的檢出率僅為50%[11，12]，本研究與其相一致。pH為4~4.5時，無齲組雖然產酸，但與高齲的產酸能力差別無統計學意義（P>0.05）；pH升至6~7.0時，無齲與高齲的產酸能力差別尚無統計學意義（P>0.05），可能是糖酵解開始發生和達到最大臨界值時，遺傳主導的變形鏈球菌在不同個體中表現和能力各異，致齲能力結果不同[13]，這也充分解釋齲病致病因素的宿主個性化特點。pH為5~5.5時，致齲菌生長趨勢下，高齲與無齲產酸能力差別有統計學意義（P<0.05），說明這一基線水平患齲率、齲壞程度與菌株敏感性相關。pH值4.5條件下，高齲組與無齲組菌株耐酸性有差別有統計學意義（P<0.05），其他pH環境中，菌株生長受到抑制，兩組間差別尚無統計學意義（P>0.05），在復雜的口腔微生態環境中，細菌生存于適合自己的環境，基因類型及其遺傳多態性可能是酸反應效應與齲病結果不同的原因[14，15]。

本實驗依據生理生化和16SrDNA相結合的方法對變形鏈球菌進行鑒定，確定培養篩選的細菌為變形鏈球菌，為下一步實驗研究打下了基礎。變形鏈球菌臨床株F-ATPase亞基uncD基因擴增反應條帶清晰，確保了基因型純度。與耐酸有關的質子移位膜ATP酶（membrane-bound proton-translocating F-ATPase）是一種重要的致齲酶，在齲病的發生發展中發揮重要的毒力作用，通過排除H+，維持跨膜pH梯度，與細菌的耐酸能力密切相關，它既增加變鏈菌的致齲性，又發揮不同齲敏感的競爭能力。本研究對內蒙古的蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌的耐酸菌株利用限制性內切酶長度多態性分析和核酸測序比較突變位點，在限制性內切酶Alu和Hinf作用下分析發現uncD的基因型存在A、B兩組基因型，高齲者以B型為主，低齲者以A型為主，且不同耐酸菌株中分布差別有統計學意義（P<0.05），不同齲敏感性所含的齲病基因數量、類型有差別，證實了蒙古族口腔變形鏈球菌uncD具有遺傳多態性。不同種族與齲病相關性國內外也有報道：烏魯木齊市維吾爾族兒童口腔分離的變鏈菌耐酸因子F-ATPase主要功能亞基uncD、uncEBF具有遺傳多態性，與菌株耐酸能力相關，不同齲敏感巴西學齡前兒童S.mutans中高齲組攜帶更多的基因型。美國黑人不同齲敏感兒童S.mutans基因多態性與攜帶基因型呈相關關系。

綜上所述，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌產酸耐酸能力不同，PH值的變化與變形鏈球菌的產酸和耐酸能力有一定關系，這也提示著齲病的發生與變形鏈球菌的產酸和耐酸能力有關，同時，變形鏈球菌的耐酸因子F-ATPase亞基uncD具有遺傳多態性，與致齲嚴重性相關，但未發現uncD具有特殊基因型與種族齲病關聯性，這需要我們對蒙古族兒童口腔變形鏈球菌的耐酸因子的其他基因型進一步研究。