G-test在肝細胞癌篩查中的診斷價值

楊雪 陸觀珠 杜成坎 王博成 許潔 包玉潔

全球每年原發(fā)性肝癌發(fā)病率位居新發(fā)惡性腫瘤的第6位，病死率占惡性腫瘤的第3位[1-2]。肝細胞癌(HCC)的預(yù)后不良，早期HCC患者可通過手術(shù)切除治愈及改善預(yù)后，但我國原發(fā)性肝癌患者的5年生存率僅為12%[3]。HCC發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時常已至疾病晚期，嚴重影響患者長期生存[4]。因此，提高早期診斷率對于提高患者預(yù)后具有重要意義。

有研究提示寡糖鏈作為生物標志物診斷HCC有著重要的意義[5-8]。本研究使用熒光毛細血管法寡糖鏈檢測(G-test)試劑盒對患者中血清多組寡糖鏈進行檢測，旨在探討多組寡糖鏈是否能夠作為HCC診斷的血清標志物，并聯(lián)合常用標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)以提高HCC的診斷率。

資料與方法

一、研究對象

本研究為回顧性研究，收集2019年1月至8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院感染科住院的HCC及有高危因素的非HCC慢性肝病患者。

納入標準：①年齡大于18歲；②臨床診斷為HCC患者及考慮存在HCC高危因素的非HCC慢性肝病患者。原發(fā)性HCC診斷標準：依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》，病理診斷為HCC，伴或不伴其他部位轉(zhuǎn)移，慢性乙型病毒性肝炎依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》。

排除標準：①急性病毒性肝炎患者；②合并其他部位的原發(fā)性腫瘤；③合并妊娠或者哺乳期婦女；④既往診斷有其他腫瘤；⑤近期有胎盤或含胎盤成分中藥服用者。

三、研究方法

通過對患者兩種血清標志物進行檢測，統(tǒng)計學(xué)分析兩者對HCC的診斷價值：應(yīng)用G-test法寡糖鏈檢測試劑盒(江蘇,先思達)，使用ABI3500Dx基因分析儀(Applied Biosystems)對樣本進行毛細管電泳得到糖組學(xué)圖譜，對檢測的9個寡糖鏈組分的含量進行圖譜分析，檢測取G值為5作為標準，≥5為陽性，<5為陰性，檢測在上海市兒童醫(yī)院檢驗科完成。應(yīng)用甲胎蛋白試劑盒(雅培) 使用雅培i2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測患者血清中AFP定量值，參考值為0～15 ng/mL，檢測在上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院檢驗科完成。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS23.0(IBM,USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用ROC曲線進行診斷效能分析，采用z檢驗比較不同參數(shù)間AUC，采用卡方檢驗比較不同組間G-test陽性率一致性。使用Mcnemar檢驗對比組間AUC的差異。P<0.05為判定結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、研究對象的基本資料

本研究數(shù)據(jù)共收集病例73例，確診HCC患者30例及有高危因素的非HCC慢性肝病患者43例的血清樣本，其中男性54例，女性19例，年齡分布24～92歲(中位年齡56歲)(表1)。

表1 研究對象基本情況

二、G-test和AFP檢測結(jié)果

經(jīng)確診的30例HCC患者中使用G-test 檢測方法陽性率90.0%(27/30)，AFP檢測陽性率50.0%(15/30)；非HCC患者中G-test 檢測方法陽性率46.5%(20/43)，AFP在非HCC患者中的陽性率13.9%(6/43)(表2)。

表2 G-test和甲胎蛋白的檢測結(jié)果

經(jīng)過卡方檢驗，非HCC組G test陽性率低于HCC組，P=0.000，非HCC組AFP陽性率低于HCC組，P=0.001，具有統(tǒng)計學(xué)差異。

通過卡方檢驗，兩組間性別、ALT分布未見顯著性差異(P>0.05)。通過獨立樣本t檢驗，HCC組年齡高于非HCC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

通過ROC曲線下面積計算，單獨檢測G-test(AUC=0.701)或AFP (AUC=0.680)診斷HCC的敏感性，未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.7648)(圖1)。

單獨檢測G-test的AUC為0.701，單獨檢測AFP的AUC為0.680。使用Z檢驗，兩方法間AUC的P值為0.7648，未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。圖1 獨立檢測G-test或AFP診斷AFP的靈敏度檢測

進一步對比兩者在肝細胞癌診斷中的特異度和靈敏度，并使用Mcnemar檢驗兩者之間的差異。在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，特異度為53.5%；AFP的靈敏度為50.0%，特異度為86.0%(P<0.05)。以上結(jié)果提示G-test的靈敏度顯著高于AFP (P=0.003)，而AFP的特異度高于G-test (P=0.003)(表3)。

表3 兩種血清標志物診斷效能評價

使用Mcnemar檢驗，在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，特異度為53.5%，P<0.05；AFP的靈敏度為50.0%，特異度為86.0%，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、G-test及AFP聯(lián)合診斷的結(jié)果

對G-test與AFP同時陽性，或兩者之間有一項陽性的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示：經(jīng)確診的30例HCC患者中，G-test和AFP均陽性46.7%(14/30)，G-test和AFP均陰性為10.0%(3/30)，G-test或AFP陽性為43.3%(13/30)；非HCC患者中，G-test和AFP均陽性0%(0/43)，G-test和AFP均陰性為39.5%(17/43)，G-test或AFP陽性為60.5%(26/43)(表4)。

表4 G-test及AFP聯(lián)合檢測結(jié)果

對兩組檢測方法得到的結(jié)果計算受試者操作特征曲線(ROC)下面積(AUC)，得到：G-test陽性或AFP陽性的AUC為0.671，兩者同時陽性的AUC為0.698。G-test陽性或AFP陽性的患者同時陽性的靈敏度最高，達90.0%，兩者同時陽性的特異度最高，為93.0% (圖2，表5)。

受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)，得到：G-test陽性或AFP陽性的AUC為0.671，兩者同時陽性的AUC為0.698。圖2 G-test及AFP聯(lián)合檢測受試者工作特征曲線下面積(ROC-AUC)

采用Mcnemar檢驗分析，G-test陽性或AFP陽性診斷靈敏度高于單獨測AFP陽性，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，甲胎蛋白特異度高于G-test陽性或AFP陽性(P<0.05)。G-test和AFP均陽性的靈敏度與單獨AFP陽性未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，G-test和AFP均陽性的特異度度與單獨AFP陽性存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表5)。

表5 G-test及AFP單獨及聯(lián)合檢測診斷效能評價

經(jīng)過卡方檢驗，HCC組兩診斷皆為陽性率高于非HCC組，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，HCC組兩診斷皆為陰性率低于非HCC組，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

由于AFP異質(zhì)體以及膽管細胞癌中AFP陰性表達，導(dǎo)致AFP用于診斷HCC時，部分患者出現(xiàn)假陰性。對這部分患者的診斷亟需篩選新的敏感的標志物以提高其診出率[9]。

糖基化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，糖蛋白的N-糖基化分布的改變在惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，已有一些糖蛋白作為卵巢癌和乳腺癌生物標志物[10-11]。既往有研究發(fā)現(xiàn)糖組學(xué)的改變與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，LIU等人發(fā)現(xiàn)，在慢性肝病患者與HCC患者血清中N-聚糖之間差異分析，有57種N-聚糖豐度發(fā)生顯著變化[12]。隨后許多研究證實特異性N-聚糖變化與HCC發(fā)生相關(guān)，提示N-聚糖作為生物標志物診斷HCC有著重要的意義[5-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用G-test法對寡糖鏈進行檢測，對血清中N-糖鏈進行熒光標記后檢測得到糖組學(xué)圖譜，并對其結(jié)果分析后得到G值對診斷HCC具有較好的診斷意義：針對本次樣本中的檢測，單獨檢測G-test的AUC為0.701，單獨檢測AFP的AUC為0.680。使用Z檢驗，兩方法間AUC的P值為0.7648。未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。提示G-test與AFP兩種方式均可作為HCC診斷的血清標志物。但結(jié)果顯示：在診斷靈敏度中，G-test的靈敏度為86.7%，顯著高于AFP (P=0.003)，更適用于篩選肝細胞癌患者，而AFP的特異度為86.5%，高于G-test (P<0.05)，更適用于排除肝細胞癌診斷；兩種檢測方式單獨使用時均存在一定的不足。當(dāng)同時使用兩種檢測方式，且 G-test和AFP二者均為陽性時，診斷患者HCC的靈敏度可達90.0% ，特異度達93.0%，且兩者同時陽性的特異度為74.0%。提示兩種檢測方式聯(lián)合使用時，可更準確地提高HCC的診斷，減少誤診率和漏診率。因此，本研究結(jié)果提示G-test聯(lián)合AFP檢測可以作為一種非創(chuàng)傷性的檢測手段，提高HCC的診斷效力。作為一種血清學(xué)標志物檢測，該方法更方便易行，兩者聯(lián)合進行HCC診斷突顯出其獨特的優(yōu)越性，更有利于在高危因素患者隨訪過程中使用。

本研究樣本量較少，后續(xù)筆者會擴大樣本量驗證本研究結(jié)果。其次，本研究持續(xù)時間較短，未能追蹤高?；颊咧蠫-test陽性高?；颊叩腍CC發(fā)病情況。在未來的研究中有必要開展大樣本多中心前瞻性研究確證本研究結(jié)果。