人布氏桿菌病實驗室診斷技術及治療*

劉 丹 趙世剛 趙婷婷

內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古呼和浩特市 010000

近年來，我國布氏桿菌病有向非牧區擴散的趨勢，受疾病影響地區已擴展到南部沿海和西南地區，布氏桿菌病疫情防控形勢嚴峻[1]。布氏桿菌侵入人體后隨血流到達全身各個部位，使布氏桿菌病的臨床表現因其受累部位及病程長短不同而表現不一且缺乏特異性，隨著解熱鎮痛藥及抗生素的廣泛應用，原本典型的“波狀熱”不易顯現，加之有時患者處于疾病初期，癥狀輕微而被本人忽視，疾病的轉歸往往不理想。

1 實驗室檢查技術進展

由于布氏桿菌病的臨床表現復雜多樣，快速、準確、易行的實驗室檢測方法對于早期診斷該病來說至關重要。目前診斷布氏桿菌病的方法雖多，卻往往存在著靈敏度低、特異性差、費時費力、甚至潛在的生物風險等缺陷。

1.1 細菌培養 從患者血液及其他受感染組織中分離培養出該菌判為培養陽性，是診斷此病的金標準。血液較易獲得且陽性率較其他組織成分高，因此血培養是檢測此病較常用、較理想的方法。但是，布氏桿菌的生長速度慢、培養操作要求高且風險較高，易受疾病階段及就診前抗生素使用的影響，導致培養結果陽性率低，分離鑒定存在較大難度，容易漏診及誤診。

1.2 血象變化 國外有研究表明[2]，布魯氏菌病患者的血象相對特異，為CRP顯著升高，白細胞計數增加，血小板及淋巴細胞計數減少，這可用于布氏桿菌感染人類的初步診斷和評估。

1.3 血清學檢測 與培養方法比較，血清學試驗快速、無危害、更敏感，在常規的臨床實驗室更容易操作。

1.3.1 特異性凝集試驗：包括平板凝集試驗(PAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)及試管凝集試驗(SAT)。臨床上常使用PAT、RBPT進行大面積篩查，之后用SAT進行復核及定量檢測，這被用作我國布氏桿菌病的確診試驗。上述凝集試驗均存在交叉反應而出現假陽性結果。

1.3.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：許多研究都得出ELISA特異性優于試管凝集試驗的結論。但該試驗所需試劑盒價格較貴，抗體保存時間及條件嚴格，操作過程用時較長，適用于科研而不適宜用作該病的篩查方法。

1.3.3 其他血清學實驗：(1)補體結合實驗(CFT)：補體結合的目標是抗原抗體復合物，有研究使用完整的布氏桿菌菌體或其提取物為抗原、以豚鼠血清為補體進行該實驗，間接測定患者血清中抗布氏桿菌抗體，得出特異性較好、靈敏度較差的結論。由于其具有高度特異性，是目前血清學試驗中最為準確的技術之一，且國際有統一的判定標準，可用作該病的確診實驗之一[3]。缺點是操作技術復雜，相對耗時。(2)免疫膠體金技術(GICA)：膠體金能快、準、穩地與目標蛋白結合而不改變其生物性狀，可利用該技術用膠體金標記 proteinA以間接檢測血清中的抗布氏桿菌抗體，這種技術的特異度及靈敏度均較高，且操作簡便，能快速得出結果，適宜于在基層單位開展應用[3]。(3)免疫捕獲凝集技術(BICA)：是檢測所有針對布氏桿菌的免疫球蛋白的一種方法。BICA可以幫助發現患病病程較長的患者，故可以用來區分急性和慢性感染，而這是使用SAT無法辨別的。在治愈的患者中，包括BICA在內的很多檢測方法在疾病治愈后可能會長時間持續保持陽性，但相比于其他檢測方法，BICA在治愈后患者的特異性抗體滴度下降比其他檢測方法更快。鑒于BICA特異性較高，而i-ELISA的靈敏度很高，可考慮與ELISA聯合使用起到互補作用[4]。(4)超靈敏雙色布氏桿菌測定(LFIA)：是一種側向流免疫測定法,朱明松等制備了榴梿樣金納米顆粒(GND)，并用葡萄球菌蛋白A標記，用來檢測布氏桿菌抗體，觀察到診斷靈敏度和特異性為100%。無須樣品預處理或血液過濾墊即可檢測血清、血漿甚至全血中的抗體，再加上其100%的靈敏度及特異度，可用于布氏桿菌病的早期診斷[5]。(5)免疫熒光染色(IFS)：是檢測外周血單個核細胞中布魯氏菌抗原的靈敏方法，楊恒等人的研究認為IFS可在臨床實踐中用于布魯氏菌病的診斷和治療監測[6]。(6)布氏桿菌凝膠試驗(BCGT)：STA和BICA至少需要18～24h的培養時間，而BCGT不需要太多時間，也不需要太多的預處理，在2h內即可得到結果。BCGT的敏感性和特異性都相對較好，可用作布氏桿菌病的篩查及早期診斷[7]。(7)免疫磁珠技術：李莉等人新開發的一種基于免疫磁珠(IMB)探針和量子點(QDs)——葡萄球菌蛋白a(SPA)探針的快速、靈敏、準確的布氏桿菌病診斷方法。該方法診斷靈敏度為96.15%(95%CI，91.82%～98.58%)，特異性為94.12%(95%CI，87.64%～97.81%)，熒光強度截止值為150.4，檢測時間僅為100min，可應用于布氏桿菌病的診斷。該方法檢測時間僅為100min，包括富集時間和標記時間，相比于i-ELISA包括血清反應時間、二次抗體反應時間和顯色時間的160min檢測時間，這種方法更高效[8]。(8) Coombs Wright：與大多數感染性疾病相比，布氏桿菌病的IgM反應在急性期后仍然存在，IgG反應在改善后往往會減弱，IgG抗體沒有終身陽性。2-ME：僅測量IgG抗體。IgG的降低比IgM的水平更好，表明治療成功。據報道，IgG水平的快速下降是反應治療成功的指標。在慢性布魯氏菌病中，凝集素IgG被非凝集素IgG代替，這只能通過Coombs Wright進行測量。在急性病例中，STA和Coombs Wright檢驗一定同時具有不同的滴度(由于存在凝集素和非凝集素抗體； Coombs Wright陰性和STA陽性)，而在慢性布魯氏菌病中，通常期望相同的滴度(兩種檢驗均為陽性)。因此，如果個體中僅存在IgM抗體，相同滴度的Wright和Coombs且2-ME試驗陽性可能會導致誤診和過度治療[9]。

1.4 分子生物學技術 大量的臨床試驗發現，傳統 PCR 技術具有高靈敏度，多重PCR具有高特異度，Real-time PCR 技術同時具備前兩者的優點，且檢測時間不足2h，重現性較好，易于標準化，臨床上多使用該技術作為療效的監測及評估。雖然進行PCR檢測的時間不長，但前期需在患者的血液中提取布氏桿菌的DNA，這個過程需要至少48～72h，這限制了PCR在布氏桿菌病診斷中的應用[10]。

2 治療現狀

治療原則為早期、規范、足量、聯合，目的是緩解患者急性期癥狀，預防疾病轉為慢性、反復發作。

2.1 傳統治療

2.1.1 主要用藥方案：(1)急性期治療：①對癥支持治療：布氏桿菌病屬于消耗性疾病，病程中除對癥處理外需臥床靜養，保證日常所需足夠的能量攝取。②病原學治療：根據臨床已有的治療經驗來看，單一用藥治療該病易復發，目前公認聯合應用2～3種抗生素：四環素類+利福平+氨基糖苷類/磺胺類/頭孢類/喹諾酮類，治療效果肯定，四環素類藥物廉價、易購、副作用小；利福霉素類藥物的副作用較大，治療療程根據病情需要，最短6周，最長可規律用藥半年以上甚至更長。(2)慢性及亞急性布氏桿菌病的治療：①菌苗療法：即脫敏療法。近期治療顯效率明顯優于遠期，可達70%以上。因其副作用大，所以患有心、肝、腎等臟器基礎疾病及孕婦禁用。②抗菌治療：同急性期，必要時重復多個療程。國外研究表明，療程不足5個月者復發率較高，對于有效治療并發癥及預防復發，三聯用藥為佳。(3)并發癥的治療：為將已產生的并發癥造成的損害降到最低，在三聯使用抗生素的基礎上根據病情需要采用理療、針灸、手術等治療方法。

2.1.2 傳統療法上的新觀點： 雖然調查研究[11]發現，最常使用的治療方案仍是多西環素+利福平，但是國內外很多研究[12]目前支持在三藥聯合治療中，多西環素為必須用藥，可搭配另外兩種非利福霉素類抗生素或者一種非利福霉素類抗生素+一種中藥制劑(如復方甘草酸苷)，這種聯合用藥均療效肯定，不易復發。這個發現有利于克服利福霉素類長期應用帶來的副作用及有些抗生素易產生耐藥性的短板，這需要更多的臨床試驗、觀察來驗證。復雜病例中建議三藥聯用，而對于短期治療，兩種藥物聯合應用或許見效更快，依據病情適當延長療程可有效減少復發。

2.2 中西醫結合、蒙醫西醫結合 主要應用抗生素的西醫療法結合中醫、蒙醫等領域的藥物或其特色療法對慢性布氏桿菌病及產生并發癥的患者進行治療。在急性期，中西醫聯合用藥可明顯減輕機體炎性反應，緩解病情；慢性期，在抗生素治療的基礎上，聯合使用小柴胡湯等中藥方劑可有效降低復發率；出現并發癥時，予拔罐、針灸等中醫特色治療亦療效顯著。

2.3 其他有效藥物探索

2.3.1 胸腺五肽[13]：能增強巨噬細胞清除病原體的作用，幫助抗生素清除定植在細胞內的布氏桿菌。在常規抗生素治療的基礎上可加用胸腺五肽等免疫調節劑作為治療慢性布氏桿菌病的輔助用藥。

2.3.2 牛磺去氧膽酸藥物：Coronas-Serna等的研究[14]發現，通過牛磺去氧膽酸藥物對UPR的破壞可以抑制布氏桿菌的繁殖。該藥可以成為布氏桿菌病的一個新型靶向藥物。

2.3.3 人參皂苷A(RGSF-A)[12]：它通過參與MAPKs(促分裂原激活的蛋白激酶)的下調，限制了F-肌動蛋白的聚合并抑制布氏桿菌滲透到細胞中。LAMP-1是跨膜蛋白，負責溶酶體與吞噬體的融合，使BCP與溶酶體連接并消除細菌，RGSF-A通過促進布氏桿菌LAMP-1的含吞噬體(BCP)的相互作用，影響布氏桿菌的胞內運輸。Huy TX等人的研究[15]已證明RGSF-A的人參皂苷Rg3-人參二醇皂苷成分已成為控制布氏桿菌病的主要因素，將其作為主要成分制成藥物將對布氏桿菌病的治療提供更多的選擇。

2.3.4 利福布汀：實際上是一種利福平衍生物藥物，能像利福平一樣阻斷RNA聚合酶的酶，此外還能減少與其他藥物的相互作用。Oguz Karabay的臨床資料[16]發現利福布汀、氧氟沙星和頭孢曲松聯合用藥成功用于1例對多種治療布氏桿菌病的常用藥物耐受患者的治療，該藥可作為利福平等常用藥物耐受的替代用藥。

3 小結與展望

如前所述，布氏桿菌病目前防控形勢嚴峻。醫務人員尤其是非疫區的醫務人員應當重視起來，病史采集中注意詢問牛羊接觸史等可有效減少漏診。目前人類被感染的影響因素有：直接接觸患病動物(包括牲畜、寵物及觀賞性動物)、食用動物源性污染的食品、實驗研發生產等職業暴露[17]。職業相關人員做好個人防護及普通人群不食用半熟或不熟動物源性食物是重要的預防措施。另外，建立一套針對布氏桿菌病的快速、準確、靈敏、易行、省時的檢測方法是重中之重，以便用于疾病的早期診斷。本文已列舉了目前布氏桿菌病現有實驗室檢測方法，傳統方法具有靈敏度、特異度低及操作復雜、耗時等缺點，新研究的幾種方法靈敏度及特異性較高但缺乏大量臨床驗證。一方面，應當繼續探索新的診斷技術，另一方面，也應當同時進行大量的臨床試驗來選定高效確診的一套檢驗方法最佳組合。就該病的治療來講，2～3種抗生素的聯合使用是公認有效的治療方法，但抗生素類藥物存在易產生耐藥性及副作用大等缺點，新型藥物的研制為患者帶來了福音，如何選用藥物、所產生的治療效果如何最大化都需要大量臨床試驗來驗證。中醫、蒙醫及其他少數民族特有的醫術，能流傳至今都有其發光點，與西醫結合共同治療布氏桿菌病及其并發癥是治療方面新的思路，在治療中因地制宜的融入其中將取得不錯的療效。