迷迭香酸對脂多糖誘導小鼠神經炎癥的影響

余 意，陳建雄，管江麗，祁克明，魏藝聰，盧 偉*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州350122）

神經炎癥是發生在神經系統的特殊免疫應答，它與許多腦部神經疾病的發展緊密相關，如多發性硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等［1］。神經炎癥的發生常常伴隨著促炎細胞因子水平的升高［2-3］。小膠質細胞作為中樞神經系統的第一道免疫防線，在免疫異常所誘發的各種神經退行性疾病中發揮著重要作用。小膠質細胞是中樞神經系統主要的固有免疫細胞，也是神經系統中專職的巨噬細胞，負責免疫監控、抗原呈遞、吞噬碎片、分泌調節性免疫分子等［4］。而在病理條件下，炎性細胞、巨噬細胞和膠質細胞等會大量表達誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），從而誘導產生過量的NO，在中樞神經系統引起神經毒性反應，所以iNOS被認為是一種“病理型”的酶［5］。因此，當小膠質細胞受到外界刺激而被激活后，會釋放NO等神經毒性物質和各種炎性細胞因子，這些物質往往會引起炎癥反應級聯放大，若得不到及時清除，最終會造成中樞神經系統退行性疾病［6-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）系酚酸類化合物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫抑制、保護神經元等多種生理活性［9-12］。本研究旨在通過RA干預脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠及BV2細胞實驗，探究RA對LPS誘導小鼠神經炎癥的影響以及對BV2炎癥反應的影響，以期為RA在新藥的開發以及相關疾病的治療上提供實驗數據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6～8周的C57BL／6雄性小鼠39只，體質量（22±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：CXK（滬）2012-0002，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，使用許可證號：SYXK（閩）2014-005。24 h恒溫（21～23℃）恒濕（55%～75%），模擬自然晝夜變化（6∶00—18∶00給予光照，其他時間為黑夜狀態），自由飲水飲食。

1.2 細胞株 小鼠小膠質細胞BV2細胞株通過上海復祥生物科技有限公司采購于American Type Tissue Culture Collection（ATCC）。

1.3 實驗試劑 迷迭香酸（北京百靈威科技有限公司，純度≥98%，貨號：547770）；脂多糖（美國Sigma公司，貨號：L2630）；RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：C11875500BT、10099141）；Penicillin-Streptomycin Solution、Phosphate Buffered Saline（美國Hyclone公司，貨號：sv30010、SH30256.01）；iNOS抗體（美國SANTA CRUZ公司，貨號：sc-650）；β-actin抗體（北京全式金生物技術有限公司，貨號：HC201）；辣根過氧化物酶標記的二抗（北京依瑪博科技有限公司，貨號：EM35110，EM35111，按1∶20000稀釋）；ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018A）；一氧化氮測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A013-2-1）；Mouse IL-6 ELISA Kit（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0411）；Mouse IL-1beta ELISA Kit（上海恪敏生物科技有限公司，貨號：EM001-96）。

1.4 實驗儀器 Nfinite M200 Pro多功能酶標儀（TECAN）；PowerPac Basic基礎電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統（Bio-rad）；HERACELL 150i細胞培養箱（Thermo Fisher）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（AIRTECH）；Centrifuge5418高速離心機（Eppendorf）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；EX224電子天平（OHAUS）；Carl Zeiss AG激光共聚焦顯微鏡（Oberkochen，Germany）。

2 實驗方法

2.1 干預與造模 C57BL／6小鼠購進適應性喂養1周后，隨機分成對照組、LPS組、LPS＋RA低劑量組、LPS＋RA中劑量組、LPS＋RA高劑量組，每組各6只，用于分子指標檢測。將RA溶于生理鹽水，LPS＋RA低劑量組、LPS＋RA中劑量組、LPS＋RA高劑量組于麻醉前30 min分別按40、60、80mg／kg腹腔注射RA溶液。水合氯醛用生理鹽水溶解，按400mg／kg進行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉后，剪開頭皮，查找前囪點，以前囪為原點，向后0.2～0.5mm，統一向右旁開1.0～1.5mm切口，深度2.0～3.0mm，以0.1μL／s的速度進行側腦室注射，LPS給藥量為100μg／kg，停針30 s使藥物擴散。注射完后縫合切口，并在切口處涂慶大霉素以防止感染，并涂苦味酸防止互咬傷口，放回籠中飼養24 h。斷頭取腦（去除嗅球、小腦和腦干），放入液氮中保存。研缽高溫烘烤滅菌后，將腦組織在研缽里加液氮研成粉末。將粉末按100 mg每管分裝到無菌無酶EP管中，放入液氮保存。

2.2 大腦神經細胞形態觀察 隨機選取9只小鼠，分為對照組、LPS組、LPS＋RA高劑量組，按“2.1”步驟給藥，24 h后進行麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，然后用鑷子提起心尖將針頭插入左心室，剪穿右心耳，緩慢注射生理鹽水進行灌流，至肺和肝的顏色都變成灰白色。換用4%的多聚甲醛灌注至小鼠四肢僵硬。斷頭取腦，置于多聚甲醛固定24 h。進行常規的石蠟包埋，按厚度5μm進行冠狀切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察神經細胞形態的變化。

2.3 免疫熒光實驗 受試腦切片用0.5%Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室溫下封閉2 h后，加入兔抗iNOS一抗（1∶200），4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入FITC標記的二抗，37℃避光孵育60 min PBS洗滌后，滴加3mg／L的DAPI，避光孵育5 min，對標本進行核染，洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.4 細胞培養 小鼠小膠質細胞BV2培養于含10%胎牛血清和1%Penicillin-Streptomycin雙抗的RPMI-1640培養基中，培養于37℃、5%CO2的培養箱中。當細胞超過80%匯合度時，進行細胞傳代培養。按2×105／mL濃度將細胞接種于六孔板中，每孔2mL，培養24h，細胞密度約80%，換含1%胎牛血清含藥培養基培養。給藥終濃度分別為LPS 100 ng／mL，RA 50、100、200μmol／L，繼續培養24 h。

2.5 qPCR檢測相關基因表達變化 小心吸去培養液，向每孔中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 1mL提取總RNA，用移液槍吸取液體反復吹打，使細胞能夠充分裂解。將充分裂解的溶液小心移入無菌無酶EP管中，按試劑盒方法進行總RNA的提取。GAPDH：上游CAACGGGAAACCCAT CACCA，下游ACGCCAGTAGACTCCACGACAT；CD14：上游AAACTCGCTCAATCTGTCTTTCACT，下游GGG TTCCTATCCAGCCTGTTGT；CD44：上游TGGGTTCA TAGAAGGAAATGTGGTA，下游TGTCATAGTGGGA GGTGTTGGA；MCP-1：上游CCACTCACCTGCTGCT ACTCATT，下游GTATGTCTGGACCCATTCCTTCTTG；MIP-1α：上游GCTCCCAGCCAGGTGTCATTTT，下游AAGACTCTCAGGCATTCAGTTCCAG。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄成cDNA，再用SYBR Select Master Mix試劑盒進行qPCR。

2.6 NO濃度測定 收集細胞培養液，再向每孔細胞中加入200μL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后收集于離心管中。兩者經離心后用NO測定試劑盒測定NO濃度。

2.7 Western blot法檢測iNOS蛋白表達 小心吸去培養液，向每孔加入150μL含PMSF的RIPA裂解液，反復吹打后離心，取上清。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，調齊濃度，向樣品蛋白中加入適量5×Loading Buffer使混合溶液終濃度為1×。震蕩混勻后100℃變性10 min，經電泳、轉膜、封閉、孵育一抗（iNOS抗體1:200；β-actin抗體1:1000）、孵育二抗（1:20000）后進行顯影，用Image Lab軟件進行分析處理，以目的蛋白的灰度和βactin灰度的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，結果以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 RA對LPS引起小鼠大腦神經細胞形態改變的影響 采用HE染色觀察小鼠大腦海馬區神經細胞形態的改變。如圖中虛框所示，對照組小鼠大腦神經細胞沒有明顯變化，細胞排列較為緊密整齊，層次較多，細胞核大而圓，核仁明顯。LPS組小鼠大腦海馬區神經細胞排列稀疏散亂，少量細胞核結構不清晰，呈不規則狀，有固縮情況。RA給藥組能夠明顯改善LPS引起的改變，見圖1。

3.2 RA對LPS引起小鼠大腦中細胞炎性基因表達的影響 免疫熒光檢測結果顯示，對照組iNOS表達量很低，LPS組小鼠大腦中海馬區中iNOS表達顯著增加，而在RA干預后，iNOS的表達明顯降低，見圖2。qPCR法檢測結果顯示，LPS單獨刺激會增加CD14、CD44、MCP-1與MIP-1αmRNA的表達，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加 的表達，見圖3。

圖1 小鼠大腦海馬區神經細胞HE染色圖（×200）

圖2 小鼠大腦海馬區iNOS免疫熒光圖（×200）

圖3 RA對LPS誘導小鼠大腦中CD14、CD44、MCP-1和MIP1αmRNA表達影響

3.3 RA對LPS誘導BV2細胞的NO濃度和iNOS蛋白表達的影響 Western blot檢測iNOS表達變化情況，正常情況下，iNOS表達量很低，在LPS刺激下表達增加，而在RA干預后，iNOS的表達降低，且呈明顯的量效關系，見圖4。

圖4 RA對LPS誘導BV2細胞的NO濃度和iNOS蛋白表達的影響

3.4 RA對LPS誘導BV2細胞炎癥基因表達的影響 結果顯示LPS單獨刺激會增加CD14、CD44 mRNA的表達，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加的表達，見圖5。

4 討論

已有研究表明，在正常生理條件下，神經細胞產生的NO在神經系統的信號傳遞及大腦的學習記憶生理過程中發揮著重要作用。但當神經細胞受刺激而產生和釋放過量NO時，過量的NO會引起神經毒性級聯反應。過多的NO擴散至細胞外后，激活鄰近的突觸引起一系列反應使得細胞內鈣離子超載引起不良反應，而鈣離子超載是造成神經細胞損傷的重要原因之一。此外，過多的NO能抑制神經元和膠質細胞膜上的谷氨酸轉運體，致使谷氨酸在神經元外滯留，從而引起神經元的谷氨酸興奮性不良反應。過多的NO除了自身有不良反應外，其衍生物特別是過氧硝酸鹽能夠引起腦部更嚴重的損害，甚至會導致血腦屏障破壞［13-14］。在NOS中，iNOS是神經細胞受刺激損傷后產生過量NO的主要誘導酶，在神經炎癥狀態，大腦中的小膠質細胞和星性膠質細胞中iNOS的表達顯著提高，因此，iNOS常作為神經炎癥的標志物。已有研究表明，iNOS可調控CD14和CD44的表達，而CD14是一類具有比較廣泛配體特異性和模式識別功能的受體，能夠識別多種微生物產物特別是LPS并引起炎癥反應，CD44是透明質酸的主要受體，CD44與透明質酸的相互作用在炎癥過程中起重要的作用，CD14和CD44的擴大表達可導致炎癥的級聯反應，在神經炎性損傷中具有重要作用［15-17］。另外，MCP-1與MIP-1α等趨化因子等炎癥介質，導致炎性細胞的聚集，浸潤的炎性細胞進一步釋放這些細胞因子和趨化因子，引起神經膠質細胞的進一步活化，從而產生炎癥信號級聯擴大反應，釋放各種細胞毒性成分，導致神經細胞的損傷。因此，發現及研發抑制iNOS過量表達的藥物，對治療NO引起的神經損傷及腦部疾病具有重要意義。

圖5 迷迭香酸對LPS誘導BV2細胞的CD14和CD44 mRNA表達的影響

神經炎癥具有雙向調節作用，一方面在維持機體穩態方面起著重要作用；另一方面當反應過度時，則會損傷腦部神經及器官。本研究利用側腦室注射LPS（100μg／kg）建立神經炎癥小鼠模型，給迷迭香酸（40、60、80mg／kg）治療后，迷迭香酸能夠改善LPS誘導的小鼠神經炎癥，并且在體內與體外實驗均表明迷迭香酸可有效抑制神經炎癥。本研究顯示迷迭香酸對脂多糖誘導的小鼠神經炎癥具有明顯的改善作用，表明迷迭香酸對神經炎癥相關疾病的預防和治療方面具有重要的研究價值。