旋覆代赭湯對反流性食管炎模型大鼠食管組織及外周血中IL-18及相關促炎因子表達的影響

劉 菊 柳 媛 金振宇 薛建國 袁紅霞

（1.昆山市中醫醫院，江蘇昆山215300；2.天津中醫藥大學，天津300193）

反流性食管 炎（reflux esophagitis，RE）又稱糜爛性食管炎（erosive esophagitis，EE），是 指胃或十二指腸內容物反流入食管，引起食管黏膜損傷的一種疾病，主要病理表現為食管黏膜的炎性損傷和愈復過程[1]。RE屬于胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD），流行病 學調查顯示，GERD的全球患病率約為13.98%，中國約為4.16%，而RE約 占GERD的30%～40%[2]。RE破 壞正常的食管鱗狀上皮，并發癥包括食管潰瘍、狹窄、Barrett食管等，其中Barrett食管被認為是食管腺癌的前身。因此，早期截斷食管炎癥，對防治RE并發癥，預防食管腺癌很有必要。

有研究表明，RE并不是開始于食管黏膜表面的化學性損傷，而是始于反流物誘發的細胞因子聚集介導的食管炎癥反應[3]。白介素-18（interleukin-18，IL-18）是一種強力促炎因子，已有研究證實IL-18對Barrett食管及食管腺癌具有免疫調節作用[4-5]，但其在RE中的研究報道較少。本研究觀察了旋覆代赭湯對RE模型大鼠IL-18及相關炎癥因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、環氧合酶2（cyclooxygenase -2，COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達的影響，探索旋覆代赭湯對RE的治療機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，12周齡，體質量（220±20）g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006，合格證號：1100111911047350，飼養于天津市南開醫院實驗動物研究中心。本實驗通過天津市南開醫院實驗動物倫理委員會審查，編號：NYKKDWL-2019-083。

1.2 實驗藥物 旋覆代赭湯使用江陰天江藥業有限公司生產的顆粒劑，參考前期實驗結果[6]，將《傷寒論》第161條原方劑量按漢代度量衡折算為：旋覆花15g、赭石5g、生姜25g、半夏15g、人參10g、炙甘草15g、大棗10g。依據“人和動物體表面積折算等效劑量比率表”計算大鼠用藥劑量為人類劑量的6.25倍，顆粒劑加熱水充分攪拌后，配制成濃度為0.989g/mL的溶液。奧美拉唑腸溶片，由阿斯利康制藥有限公司生產，產品批號：J20130093；枸櫞酸莫沙必利片，由魯南貝特制藥有限公司生產，產品批號：H19990317。奧美拉唑+莫沙必利配制成濃度為0.26 mg/mL的混懸液（奧美拉唑0.208 mg/mL，莫沙必利0.052 mg/mL）。上述藥液均密封后放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：各梯度酒精、二甲苯、蘇木精/伊紅染色劑等病理染色基本試劑由天津市南開醫院中西醫結合急腹癥研究所提供；IL-18、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）法試劑盒（批號：BG190308RAC、BG190218RAC、BG190218RAC），上海藍基生物科技有限公司生產；IL-18、COX-2、iNOS抗體（批號：ab191860、ab52237、ab15323），英國Abcam公司生產；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：PAB180002、PAB180013、PAB180024），Bioswamp公司生產。

主要儀器：超薄切片機（型號：EMUC6），正置熒光顯微鏡（型號：DM400B+DFC500+LA），德國Leica公司；倒置相差光學顯微鏡（型號：IX71），日本Olympus；電子顯微鏡（型號：H7650），日本日立公司；凝膠成像系統（型號：Universal Hood Ⅱ），化學發光分析儀（型號：ChemiDocXRS），電泳儀（型號：MiNi Proteam 3 Cell），美國Bio-Rad公司；臺式冷凍離心機（型號：H2050R），湖南湘儀集團；恒溫水浴箱（型號：DZKW-4），北京中興偉業儀器有限公司；分光光度計（型號：KHB-ST-360），上海科華生物。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 60只雄性Wistar大鼠，隨機分為正常組、模型組、西藥組（奧美拉唑+莫沙必利）、中藥組（旋覆代赭湯），每組15只。除正常組外，其余各組大鼠采用“4.2 cm幽門夾+2/3胃底結扎術”[7]制備RE模型。術后24 h禁食不禁水，此后常規喂養。術后3 d內，每天每只大鼠給予1.5 mg/kg鹽酸左氧氟沙星注射液腹腔注射。

2.2 藥物干預 術后第8天開始，每日模型組給予生理鹽水1 mL/100g體質量灌胃，正常組同期予等量生理鹽水灌胃，西藥組與中藥組給予相應藥液1 mL/100g體質量灌胃，每日分2次，連續14 d。

2.3 取材 各組大鼠最后一次灌胃結束后，禁食不禁水24 h，0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射過量麻醉劑處死，常規開腹采集腹主動脈血，置于離心管中室溫靜置1 h以上，常溫825×g離心10 min，取上清，置于EP管中，-80 ℃保存待檢測，用于血清學指標測定。開腹后縱向剖開食管，觀察食管黏膜表象并進行病理分級，取胃食管交界上0.5 cm處向咽喉部截取1.5～2.0 cm食管組織，分為2份，一份制備病理切片，一份-80 ℃凍存待測。

2.4 觀察指標

2.4.1 食管黏膜肉眼表現、RE分級及病理形態學觀察 將各組大鼠食管腔用預冷的生理鹽水漂洗，縱行切開，肉眼觀察食管黏膜大體表現并進行RE分級，分級標準參考中華醫學會消化內鏡分會發布的《反流性食管炎診斷及治療指南（2003年）》[8]。取食管下段小塊組織，置于組織包埋盒中，使用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋制備病理切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，通過光鏡觀察病理形態學表現。

2.4.2 Western blot檢測食管組織中IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達 用清潔的手術剪將食管組織塊盡可能剪碎，置于EP管內稱重。按每20 mg組織200 μL裂解液的比例加入勻漿器中勻漿，置于冰上30 min，每隔10 min搖晃一次助溶，于4 ℃、1200×g離心15 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量法測定樣本蛋白濃度，制備SDS-PAGE濃縮膠及分離膠，轉膜后加入一抗、二抗孵育，凝膠成像系統顯影。

2.4.3 ELISA法檢測血清中IL-18、IL-6、TNF-α含量 將分離的血清采用雙抗體夾心法進行操作。按次序加入100 μL標準品，空白孔加入100 μL樣品，空白對照加入100 μL PBS，各孔加入50 μL酶標溶液，密封后37 ℃孵育1 h。充分洗滌酶標板，吸水紙拍干后加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃下避光反應15～20 min后加入50 μL終止液。在450 nm波長處測定各孔的OD值。以標準物的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，計算出標準曲線的回歸方程，將樣本的OD值代入方程式，計算樣本實際濃度。

2.5 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件分析數據，Graphpad 6.0繪制統計圖。等級資料組間比較采用秩和檢驗，兩兩比較采用混合排秩后行方差分析。計量資料若符合正態分布，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；若方差不齊或不符合正態分布，采用welch檢驗。組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 大鼠死亡情況 各組大鼠于處死前，共死亡8只。正常組大鼠實驗過程中無死亡；模型組1只死于幽門梗阻，1只死于腹腔感染，1只死于腸梗阻；中藥組1只死于幽門梗阻，1只死于肺感染；西藥組2只死于腹腔感染，1只死于腸梗阻。最終剩余：正常組15只，模型組12只，中藥組13只，西藥組12只。

3.2 各組大鼠食管黏膜肉眼表現及RE分級 正常組大鼠食管黏膜光滑，無肉眼可見病理改變。模型組大鼠食管黏膜充血明顯，中下端可見點片狀紅斑改變，散見針尖至米粒樣大小不等白色潰瘍，少數食管下端出現“樹皮樣”增生白斑。中藥組大鼠食管黏膜平整，多數食管下端有水腫，色澤粉紅，散見充血點，未見糜爛性潰瘍及增生白斑。西藥組大鼠食管黏膜較光滑平整，未見糜爛、潰瘍或增生白斑。各組大鼠食管黏膜肉眼RE分級見表1。

表1 各組大鼠食管黏膜肉眼RE分級 單位：只

3.3 各組大鼠食管黏膜組織病理形態學表現 正常組大鼠光鏡下可見食管黏膜層表面為非角化復層鱗狀上皮，基底細胞層中有少許黑色素母細胞和內分泌細胞。模型組可見食管鱗狀上皮基底細胞增生，固有膜乳頭延長，嗜酸性粒細胞、中性粒細胞浸潤，可見黏膜糜爛或潰瘍形成，少數有柱狀上皮化生。中藥組大鼠食管黏膜鱗狀上皮增生較少，糜爛、潰瘍等病理較少出現，黏膜間質見少許淋巴細胞及單核細胞浸潤。西藥組大鼠食管黏膜鱗狀上皮內可見慢性炎細胞浸潤，細胞間隙增寬，未見明顯糜爛、潰瘍。見圖1。

3.4 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達比較 模型組大鼠食管組織中IL-18、COX-2、iNOS 蛋白含量明顯高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥組、西藥組上述指標蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.01）；中藥組與西藥組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

圖1 各組大鼠食管黏膜組織病理表現（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達比較

表2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數/只 IL-18/GAPDH COX-2/GAPDH iNOS/GAPDH正常組 15 0.55±0.15 0.39±0.08 0.18±0.10模型組 12 1.42±0.36** 0.77±0.07** 0.71±0.09**中藥組 13 0.94±0.32△△ 0.53±0.08△△ 0.24±0.04△△西藥組 12 0.97±0.42△△ 0.48±0.05△△ 0.31±0.04△△

3.5 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達比較 模型組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達明顯高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；中藥組、西藥組上述指標表達明顯低于模型組（P＜0.05）。中藥組與西藥組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達比較（±s） 單位：pg/mL

表3 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達比較（±s） 單位：pg/mL

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 動物數/只 IL-18 IL-6 TNF-α正常組 15 170.65±14.62 18.08±7.01 168.65±9.29模型組 12 1 088.79±36.41** 81.06±9.51** 186.52±5.87**中藥組 13 933.76±39.65△ 35.97±5.59△ 177.00±6.16△西藥組 12 917.48±45.67△ 23.77±4.30△ 176.29±4.70△

4 討論

4.1 正氣不足、邪氣有余的炎癥微環境是RE的內在發病基礎 正氣是存在于人體內的一類具有調節機體功能、適應環境刺激、抵御外邪侵襲等作用的細微物質，正氣作為人體固有的生理之氣，與邪氣存在對立制約關系。“正氣存內，邪不可干”，將邪正盛衰的斗爭作為人體虛實變化及疾病產生的內在根源。體內正氣充足則衛外得固、氣機調暢，機體可維持正常生理功能，保持免疫環境穩定，抵御外在致病因素的侵襲；“邪之所湊，其氣必虛”，若正氣不足，則衛外不固，氣機升降出入失于暢達，免疫內環境失穩，外邪侵襲，外界的病原微生物或機體自帶的炎癥因子乘虛而起，形成炎癥性疾病。正氣不足、邪氣有余是慢性炎癥性疾病的內在發病基礎，治療此類慢性炎癥性疾病應著眼于扶正補虛、調節免疫[9-10]。RE是消化系統常見的慢性炎癥性疾病，炎癥反應在食管疾病中的作用已被證實，因此正氣不足導致的炎癥微環境也應成為RE治療的著眼點之一。

4.2 IL-18是炎癥免疫應答中的關鍵驅動因子 IL-18是一種強有力的促炎因子，在炎癥及免疫應答中具有重要作用。IL-18基因位于人類的11號染色體上，編碼193個氨基酸的前體，最初作為無活性的24 kDa前體合成，在巨噬細胞、小膠質細胞、人外周血單核細胞、腸上皮細胞、氣道上皮細胞等細胞中累積[11-12]。IL-18前體在細胞內被蛋白水解酶caspase 1加工成18 kDa的成熟IL-18蛋白。Caspase 1可通過與各種典型的炎性小體包括NLRP3、NLRP4、NLRP1等結合而被激活，從而促進IL-18加工成熟并釋放。成熟的IL-18通過與其受體，即IL-18R結合來發揮作用，其受體由異源二聚體組成，廣泛存在于多種細胞中，屬于IL-1R/Toll樣（TLR）受體超家族。IL-18的初級受體為IL-18Rα，共受體為IL-18Rβ，三者結合形成IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ三元復合物，觸發炎癥反應信號。IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ復合物已被證明可誘導多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等的合成和分泌[13]，與COX-2存在劑量依賴性[14]，同時參與NFκB、NLRP3、STAT3和MAPK等多條信號通路，構成復雜細胞因子網絡，形成自激活的循環連接，進而產生炎癥瀑布反應，參與多種慢性炎癥性疾病[15-16]。

4.3 旋覆代赭湯可通過益氣和胃、免疫調節治療RE 正氣不足、邪氣有余導致的慢性炎癥是“正常食管-食管炎-Barrett食管-食管腺癌”進展過程中的主要驅動因素，了解食管炎癥發生發展過程中的主要影響通路及關鍵促炎因子可以為反流性食管炎的治療提供重要參考。本實驗研究結果提示，IL-18在RE模型大鼠食管組織及血清中呈現高表達，同時促炎因子COX-2、iNOS、IL-6、TNF-α在食管及血清中也呈現高表達，提示反流性食管炎中存在多種炎癥因子的活化聚集。經方旋覆代赭湯可有效降低RE模型大鼠IL-18及相關促炎因子的含量，改善食管黏膜病理，提示旋覆代赭湯可以通過抑制促炎因子的表達，對反流性食管炎起到一定的免疫調節作用。

我們前期通過臨床研究發現，胃食管反流病患者呈現明顯的脾胃虛弱癥狀，且脾胃虛弱評分與胃食管反流癥狀評分呈正相關[17]，與患者自主神經功能減弱呈正相關[18]，提示脾胃虛弱是胃食管反流的重要發病因素，這一結果與反流性食管炎“胃虛氣逆”的關鍵病機相吻合。脾胃為后天之本，氣血生化之源，是正氣的重要補充來源，“脾胃虛弱，正氣不足”可能是機體免疫漂移、食管炎癥微環境形成的內在基礎。我們選用益氣補虛、和胃降逆之經方旋覆代赭湯治療本病臨床療效顯著。本研究驗證了旋覆代赭湯對IL-18及相關炎癥因子的抑制作用，結合前期研究，此抑炎作用的部分機制可能與其調控NF-κB、NLRP3信號通路有關[19-20]，在此過程中，IL-18是否作為關鍵炎癥細胞因子介導了免疫細胞遷移和局部聚集，尚有待進一步研究證實。