地木耳中多糖的分離純化工藝研究

何姍珊 張會香

（[1]梧州市食品藥品檢驗所 廣西·梧州 543099；[2]桂林理工大學化學與生物工程學院 廣西·桂林 541004）

1 材料與方法

1.1 試驗材料：試劑與主要儀器

可溶性淀粉、無水乙醇、正丁醇、氯化鈉、葡萄糖、苯酚、氨水、磷酸、濃硫酸、氫氧化鈉、氯仿、鹽酸、考馬斯亮藍G250（以上用到試劑均為分析純）；顆粒狀活性炭（化學純），廣東達濠精細化學品公司；AB-8大孔吸附樹脂，山東西亞化學工業(yè)有限公司；Cellulose DE-52填料。

潔凈的玻璃層析柱（1.5 cm×30 cm）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S型），金壇市醫(yī)療儀器廠；高速萬能粉碎機（FW100型），天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海傲譜分析儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-Ⅲ型），上海亞榮生化儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A型），上海亞榮生化儀器廠；離心機（DL-5-B型），上海安亭；酸度計（PB-10型），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 地木耳多糖的提取

將干燥的地木耳利用高速萬能粉碎機粉碎后干燥備用，準確稱取10 g地木耳粉末，加入適量95%乙醇浸泡3 h，過濾后干燥濾渣，接著以60:1的液料比加入蒸餾水，混合均勻后于90℃中恒溫水浴3 h，過濾后將濾渣繼續(xù)重復浸提操作4次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至適當體積，加入約3倍體積的無水乙醇，在4℃下低溫放置過夜。過夜后燒杯有白色絮狀物出現(xiàn)，4500 rpm轉(zhuǎn)速下離心20min，收集沉淀后烘干即得地木耳粗多糖約2.55 g。

1.2.2 多糖含量的測定及標準曲線的制作

準確吸取50 g/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL，各加水補至2.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，充分振蕩均勻，馬上加熱10 min，冷卻后于490 nm波長下測定吸光度。葡萄糖含量作橫坐標，吸光度值作縱坐標，繪制曲線。樣品溶液吸取2.0 mL，必要時對樣品溶液進行稀釋，按同樣操作進行吸光度的測定。

1.2.3 粗多糖中蛋白質(zhì)的測定

取試管6支，按照表1配制試劑，搖勻后靜置顯色2min，空白調(diào)零管為1號管，在595 nm波長下測出吸光度，注意應在1h內(nèi)完成比色。橫坐標為牛血清白蛋白的含量，吸光度值則為縱坐標，繪制曲線。精密吸取樣品溶液1.0mL，必要時對樣品溶液進行稀釋，加入5.0 mL考馬斯亮藍，充分混勻后靜置顯色2 min，在595 nm波長下測出吸光度值。

1.2.4 DEAE-纖維素柱層析

（1）預處理。取適量DEAE-52于燒杯中，蒸餾水溶脹24 h，而后稍稍側(cè)邊傾出表面懸浮著的細小顆粒，接著用0.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡40 min，抽濾，用蒸餾水沖洗至中性，抽濾后用0.5mol/L鹽酸溶液浸泡40min，洗至中性。抽濾后烘干過夜，備用。

（2）柱層析。采用濕法裝柱，使DEAE-52沉積高度達到玻璃柱的三分之二處，用2-3倍體積的蒸餾水達到平衡柱床作用。

1.2.5 地木耳多糖的理化性質(zhì)

碘—碘化鉀反應，取多糖樣品溶液200 L于小離心管，慢慢滴加50 L碘—碘化鉀溶液，觀察顏色變化，陰性對照是蒸餾水，陽性對照是0.5%的淀粉指示液，比較現(xiàn)象。苯酚—硫酸反應，于試管中加入多糖溶液1 mL，加入600 L的5%苯酚—硫酸溶液，接著加入625 L濃硫酸，搖勻后觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照。茚三酮反應，于試管中加入1.0 mL多糖溶液，加入茚三酮試劑1.0 mL后放入沸水浴中加熱20 min，冷卻后觀察現(xiàn)象。各取蒸餾水和小牛血清溶液（1.0 mg/mL）1.0 mL作為對照，比較現(xiàn)象。

1.2.6 地木耳多糖的穩(wěn)定性研究

（1）熱對多糖的影響。

（2）pH對地木耳多糖的影響。

分別取1 mL的多糖溶液6份，室溫下用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6、6.5、7、7.5、8、8.5，稀釋1000度后，避光保存12 h，用苯酚—濃硫酸法（1mL6%苯酚+5mL濃硫酸），加熱20 min顯色，冷卻后在490 nm處測定多糖溶液的吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 標準曲線制作

由實驗方法1.2.4和1.2.5繪制出標準曲線，見圖1和圖2。如圖1可見，葡萄糖的線性回歸方程為：y=0.0053x+0.0116，R2=0.9956。說明標準曲線的線性關系良好。如圖2可見，蛋白質(zhì)的線性回歸方程為：y=5.3214x-0.0056，R2=0.9923。說明標準曲線的線性關系良好。

圖1：葡萄糖標準曲線圖

圖2：蛋白質(zhì)標準曲線圖

2.2 地木耳粗多糖脫蛋白

分別用Sevag法和木瓜蛋白酶+Sevag法進行去蛋白處理6次，對比多糖損失率和蛋白脫除率可知，雖然兩種方法去蛋白6次的蛋白脫除率相差不大，即脫蛋白效果差不多，但用木瓜蛋白酶+Sevag法對多糖造成的損失較大，證明Sevag法作為經(jīng)典的去蛋白方法，蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率都較好，適宜用于地木耳粗多糖的脫蛋白處理。而用鹽酸法只進行去蛋白處理2次，發(fā)現(xiàn)前后兩次脫除蛋白效果差別不大，但對多糖造成的損失已經(jīng)比用Sevag法去蛋白的多，明顯不適合運用于地木耳多糖的脫蛋白處理，因此，選用Sevag法進行脫蛋白處理。

2.3 地木耳粗多糖去色素

分別用顆粒狀活性炭，雙氧水法以及大孔吸附樹脂法進行去去色素1次，在紫外—可見分光光度計掃描確定的最大吸收波長為200 nm處測定吸光度值，計算出的脫色率比較，大孔吸附樹脂法脫色率達 65.44%，脫色率較雙氧水法的51.52%以及活性炭法的9.84%高，脫色效果相對較好，但同時比較考慮對多糖的損失程度，盡管大孔吸附樹脂對多糖脫色效果好，但損害程度也高，達到了94.57%，而活性炭也達到了91.50%，雙氧水法只損失了81.40%，因此相比較之下，選擇雙氧水法進行去色素處理。

2.4 多糖的分離與純化

用 DEAE-52纖維陰離子柱層析分離開地木耳多糖的不同組分，多糖溶解后取5 mL上樣，依次用蒸餾水、0.1-0.5 mol/L NaCl進行梯度洗脫，選用苯酚—硫酸法逐管檢測出吸光度值，地木耳粗多糖通過DEAE-52纖維柱層析得到較好分離，共有明顯的8個洗脫峰，每個峰形都比較對稱，NCP1-8分別代表了洗脫出的較好的8個組分。在峰形較好時，選峰面積法進行定量，因此參考峰面積大小的不同，收集其中含量較多的NCP3、NCP4、NCP5三個組分。這三個組分都分離完全，分別合并收集這三個組分，進行濃縮處理，干燥待用。

2.5 地木耳多糖的理化性質(zhì)分析

碘—碘化鉀反應為淀粉指示劑變?yōu)樗{色，而多糖和蒸餾水無明顯變化，因此表明在碘—碘化鉀反應中顯陰性反應，說明為非淀粉多糖；苯酚—硫酸反應為多糖溶液變橙黃色，相比蒸餾水對照沒有反應，因此在苯酚—硫酸反應顯陽性反應，說明提取物是多糖。茚三酮反應為小牛血清溶液顯紫色，而蒸餾水與多糖溶液無明顯變化，因此茚三酮反應顯陰性，說明多糖溶液不含蛋白與多肽物質(zhì)。

2.6 地木耳多糖的穩(wěn)定性研究

在熱水浴70℃下，隨著時間的延長，多糖溶液的吸收值沒有明顯的變化，以及隨著溫度的變化，多糖溶液的吸收值變化很小，說明熱對地木耳多糖的穩(wěn)定性沒有明顯的影響。隨著pH的逐步增大，多糖溶液的吸收值有緩慢增大情況，在pH達到8以后增加情況明顯。說明酸性條件下，多糖是穩(wěn)定的，在堿性條件下多糖穩(wěn)定性降低，有部分水解，導致吸光度增大。

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取地木耳粗多糖，以60倍蒸餾水在90℃恒溫水浴中浸提四次，每次3 h，濃縮提取液，醇沉后離心收集沉淀，烘干后獲得粗多糖。去蛋白和去色素方法比較后，最后去蛋白方法為Sevag法，去蛋白操作8次后蛋白去除率達43.42%，多糖損失率只有12.23%，去色素方法為H202法，脫色率達51.52%。對地木耳多糖的分離純化中，用蒸餾水和幾種不同梯度的NaCl溶液為洗脫液，DEAE-52柱層析洗脫，共收集得到8種組分，選取含量較多的三個組分進行純度鑒定，各個組分經(jīng)紫外光譜掃描顯示不含核酸與蛋白質(zhì)。分離后的地木耳多糖通過理化性質(zhì)分析證明：分離后的多糖組分為非淀粉多糖且不含蛋白與多肽物質(zhì)。