水翁花總黃酮酶法提取工藝及抗氧化活性研究

葉春林，李瀚鑫，汪雅莉，陳穎

（浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023）

水翁花開始記載于《嶺南采藥錄》中，是桃金娘科植物水翁的干燥花蕾，別名水雍花、大蛇藥、水榕花、酒翁、水香。具有清熱解暑、生津止渴的功效，主要用于治療傷風感冒、口渴腹脹或嘔吐泄瀉[1]。現代藥理研究表明，水翁花具有抗炎鎮痛、抗內毒素以及保護神經細胞等作用[2-4]。

水翁花主要分布于廣東、廣西、海南、福建等省，印度、越南、馬來西亞等地也有分布。在民間應用非常廣泛，療效確切，夏季常作涼茶以解暑，也是“清熱涼茶”等中成藥的主要原料[5]。水翁花蕾中已知的化學成分有黃酮類、氨基酸、熊果酸、齊墩果酸、橙酮等[6-9]。其中，黃酮類化合物是水翁花的主要成分[10-12]，黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗腫瘤等多種作用[13-15]。本試驗以水翁花為原料，采用纖維素酶法提取水翁花中的總黃酮，利用響應面優化其提取工藝條件，并研究水翁花總黃酮的抗氧化能力，以期為水翁花的研究及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水翁花蕾：產于廣東，粉碎過60目篩；纖維素酶（biological reagen，BR）（酶活：15 000 U/g）、蘆丁標準品（光譜純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；BS224S精密天平：SARTORIUS公司；PHS-3C型pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍天化驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 水翁花總黃酮提取率的測定

參考文獻[16]，得到總黃酮質量濃度（Y，mg/mL）與吸光度（X）的標準曲線方程為Y=0.085 3X-0.000 8，R2=0.999 3。根據標準曲線，可算出總黃酮的質量濃度。

按標準曲線方程計算，按下式計算總黃酮的提取率。

式中：c為水翁花提取液總黃酮的質量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數；V為提取液體積，mL；W為提取用水翁花的質量，mg。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酶用量

精確稱取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設置溫度55℃，pH值為5.0，酶用量為0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%的條件下提取60 min。根據1.3.1項下方法，計算總黃酮的提取率。

1.3.2.2 酶解溫度

精確稱取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設置溫度40、45、50、55、60 ℃，pH 值為 5.0，酶用量為 0.50%的條件下提取60 min。根據1.3.1項下方法，計算總黃酮的提取率。

1.3.2.3 酶解時間

精確稱取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設置溫度55℃，pH值為5.0，酶用量為0.50%的條件下提取20、40、60、80、100 min。根據 1.3.1 項下方法，計算總黃酮的提取率。

1.3.2.4 pH值

精確稱取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設置溫度55℃，pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶用量為 0.50%的條件下提取60 min。根據1.3.1項下方法，計算總黃酮的提取率。

1.3.3 響應面優化試驗

以單因素試驗為基礎，以酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH 值（D）為獨立自變量，水翁花總黃酮提取率（Y）為響應值，根據Box-Behnken設計原理，進行四因素三水平響應面試驗設計[17]，因素及水平設計見表1。

表1 因素和水平設計Table 1 Design of factors and levels

1.3.4 水翁花總黃酮抗氧化活性的研究

1.3.4.1 清除ABTS+自由基能力

分別配制總黃酮質量濃度為 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mg/mL的水翁花總黃酮溶液和VC對照溶液，參照SINGH等[18]的方法測定ABTS+自由基清除率。

1.3.4.2 β-胡蘿卜素/亞油酸抗氧化體系

參照文獻[19]方法，并稍作修改。稱取0.5 mg β-胡蘿卜素、25 μL 亞油酸及 200 μL Tween-40，用氯仿將其定容到1 mL。取配好的溶液至圓底燒瓶中，40℃旋轉蒸干，然后用蒸餾水將其定容到100 mL的容量瓶中。0.5 mL 不同濃度的黃酮溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）加入2.5 mL的上述新鮮配制的β-胡蘿卜素/亞油酸介質液，50℃孵育60 min，470 nm處，測定吸光度。以丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）做陽性對照。抗氧化能力采用下式計算。

式中：A0為開始時，不同質量濃度下的吸光度；A60為孵育60 min，不同質量濃度下的吸光度；為開始時，質量濃度為0的吸光度；為孵育60 min，質量濃度為0的吸光度。

1.3.4.3 總還原能力

水翁花總黃酮的總還原能力測定，參照文獻[20]，修改如下：0.5 mL不同濃度的黃酮溶液（0.15 mg/mL～0.75 mg/mL）與 0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）充分混勻；溶液在50℃的水浴中反應30 min后，再加入10%的三氯乙酸0.5 mL，混勻。溶液在1500×g條件下，離心10min。取上清0.5 mL，與0.1 mL 0.1%FeCl3以及1.5 mL蒸餾水混勻，搖勻靜止5 min，在700 nm測吸光度。陽性對照選用 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytolu-ene，BHT）。

1.4 數據處理

用Design Expert 10.0.7軟件進行響應面分析，用OriginPro9.1軟件作圖，測定數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對總黃酮提取率的影響

酶用量對總黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 酶用量對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of cellulase dosage on yield of total flavonoids

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量增大，水翁花總黃酮的提取率呈先上升后下降的趨勢，在酶添加量為0.5%時達到最大值。其原因可能是酶用量的增加，纖維素酶與更多的水翁花細胞壁作用，促進了細胞內黃酮的溶出，提高了總黃酮提取率；而當酶用量過大時，酶與底物的作用達到飽和，酶解作用反而受到抑制，降低了提取率[21]。故酶用量選擇0.5%為0水平，進行響應面法優化。

2.1.2 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

酶解溫度對總黃酮得率的影響結果見圖2。

圖2 酶解溫度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on yield of total flavonoids

由圖2可以看出，在酶解溫度40℃～55℃時，隨著酶解溫度升高，總黃酮的提取率增大，最大值在55℃處獲得，繼續升高溫度，提取率呈下降趨勢，這可能是因為溫度升高使得酶部分或全部變性，酶的活性降低，不利于黃酮的浸出與提取[22]。故酶解溫度選擇55℃為0水平，進行響應面法優化。

2.1.3 酶解時間對總黃酮提取率的影響

酶解時間對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of hydrolysis time on yield of total flavonoids

由圖3可得，總黃酮提取率在20 min～60 min內隨著酶解時間延長而增大，再繼續增加時間，總黃酮提取率反而下降。其原因可能是剛開始，酶解時間太短，酶解反應不完全，水翁花的細胞壁在這個過程中得到的破壞不大，其中黃酮成分不易溶出，提取率較低，隨著時間的延長，黃酮成分不斷溶出，提取率升高。但酶解時間過長，部分黃酮結構受到破環，反而降低了提取率[23]。故酶解時間選擇60 min為0水平，進行響應面法優化。

2.1.4 pH值對總黃酮提取率的影響

pH值對水翁花總黃酮得率的影響結果見圖4。

圖4 pH值對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of pH on yield of total flavonoids

由圖4分析可知，當溶液pH值小于5.0時，總黃酮提取率隨著pH值的增大而增大，當pH值達到5.0時總黃酮提取率達到最大值，隨后總黃酮提取率逐漸下降。這是因為酶解反應有適宜的pH值，在此pH值條件下纖維素酶的活力最大。在水翁花總黃酮提取過程中酶在pH值為5.0時為最適宜，過高或過低的pH值，酶的活性都會降低[24]，最佳的pH值選擇為5.0。故pH值選擇5.0為0水平，進行響應面法優化。

2.2 響應面試驗

為進一步優化水翁花總黃酮提取條件，以黃酮提取率（Y）為響應值，應利用Design-Expert 10.0.7軟件中的Box-Behnken設計四因素三水平的響應面分析試驗，根據表1設定的因素和水平，共設計29個處理組，其中5個零水平處理組，響應面分析試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗結果Table 2 The result of Box-Behnken experiment

續表2 Box-Behnken試驗結果Continue table 2 The result of Box-Behnken experiment

根據表2數據進行二次多元回歸擬合，得到總黃酮提取率（Y）對酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH值（D）的回歸模型為：Y=3.81+0.22A+0.15B+0.023C-0.12D-0.018AB+0.018AC-0.16AD-0.095BC-0.010BD-0.15CD-0.053A2-0.35B2-0.53C2-0.39D2，其中Y為水翁花總黃酮提取率。對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 水翁花黃酮提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Cleistocalyx operculatus

由方差分析可知，該模型的F=30.16，P<0.000 1，回歸模型達到極顯著，能夠正確反映各因素與響應值之間的變化關系。失擬項P=0.116 4>0.05，模型失擬度不顯著，表明該模型擬合程度比較好，試驗誤差小。決定系數R2=0.969 7，表明可用該模型解釋96.97%的試驗數據；調整的確定系數，表明有93.58%的總黃酮提取率變異分布與所研究的A、B、C、D 4個工藝因素相關。模型的CV較小，為3.47%，說明試驗穩定、可靠。一次項 A、B 和二次項 A2、B2、C2、D2的 P＜0.001，表明 A、B 和 A2、B2、C2、D2對總黃酮提取率的影響是極顯著的；一次項D和交互項AD的P＜0.01，表明D和AD對總黃酮提取率的影響是高度顯著的；交互項CD的P＜0.05，表明CD對總黃酮提取率有顯著影響。而一次項 C、交互項 AB、AC、BC、BD 的 P＞0.05，表明其對總黃酮提取率沒有顯著性影響。在試驗考察范圍內，各因素對水翁花總黃酮提取率的影響主次順序為：酶用量＞酶解溫度＞pH值＞酶解時間。

應用Design-Expert 10.0.7軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應曲面圖如圖5所示。

圖5 各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface map of the effect of the interaction between the two test variables and the yield of total flavonoids

由圖5可知，各因素對水翁花總黃酮的提取率的影響不同。其中，酶用量的影響最為顯著，隨著酶用量的延長，總黃酮提取率先增大后減少，表現為曲面較陡；酶解溫度和pH值的影響次之，表現為曲面相對平緩；酶解時間的影響最小，曲面最為平緩。可見，響應面圖分析結果與方差分析結論一致。

2.3 驗證試驗

利用Design Expert 10.0.7軟件分析，得到最佳提取工藝參數為：酶用量0.558 25%、酶解溫度56.05℃、酶解時間60.74 min、pH值4.89。為便于試驗操作，將最佳提取條件進行修正為：酶用量0.56%、酶解溫度56℃、酶解時間61 min、pH值4.9，進行驗證試驗，得到水翁花總黃酮實際提取率為（3.85±0.09）%，與預測值（3.87±0.08）%穩合的很好。

2.4 抗氧化結果

2.4.1 ABTS+自由基清除作用

ABTS試劑與過二硫酸鉀反應，可以生成綠色的ABTS+自由基，該自由基在734 nm有最大吸收。加入具有抗氧化活性的物質會抑制ABTS+自由基的生成，使顏色減弱，所以，通過檢測734 nm的吸光度，可以評價抗氧化物質的抗氧化能力[25]。總黃酮對ABTS+自由基的清除作用見圖6。

圖6 總黃酮對ABTS+自由基的清除作用Fig.6 Inhibition effects of total flavonoids on ABTS+radical

由圖6可知，當水翁花總黃酮從0.15 mg/mL增加到0.75 mg/mL時，對ABTS+自由基的清除率從（19.4±2.2）%增長到70.6±3.0%。總黃酮對ABTS+自由基有很好的清除作用，對ABTS+自由基的清除率與總黃酮濃度成正比。總黃酮的IC50=0.41 mg/mL，VC的IC50=0.20 mg/mL，IC50越小說明抗氧化活性越好。

2.4.2 對β-胡蘿卜素/亞油酸體系的影響

β-胡蘿卜素/亞油酸抗氧化體系廣泛的應用于抗氧化能力的評價[26]。亞油酸自動氧化，生成的自由基與β-胡蘿卜素反應，引起β-胡蘿卜素的黃色衰減（在470nm處吸光度減小）；在有抗氧化劑存在時，褪色速度被減緩[27]。總黃酮及BHA對油脂氧化的清除率見圖7。

圖7 總黃酮對油脂氧化的抑制作用Fig.7 Inhibition effects of total flavonoids on oil oxidation

由圖7可知，總黃酮顯示出一定的抑制油脂氧化作用，并且隨著濃度的增加，對油脂氧化的抑制作用也增強，在最高質量濃度1.6 mg/mL時，對油脂氧化的清除率為（58.7±2.4）%。而BHA在此質量濃度下，清除率已達（98.6±3.3）%。

2.4.3 總還原能力的測定

物質的還原能力與其抗氧化活性之間存在密切關系。具有還原作用的物質，通過給出電子，把Fe3+還原成Fe2+，使Fe2+發生普魯士藍反應。普魯士藍在700nm處有最大吸收峰，故700 nm處吸光值越高，則還原力越強[28]。總黃酮總還原能力見圖8。

圖8 總黃酮總還原能力Fig.8 Reducing power of the of total flavonoids

從圖8可知，水翁花總黃酮的還原能力隨濃度的增大而逐漸增大，具有濃度依賴性。當濃度為0.75 mg/mL時，總黃酮和BHT的還原力（以700 nm處的OD值表示）分別為（0.60±0.03）和（0.83±0.05）。盡管黃酮的還原活性比具有極強還原能力的BHT要弱一點，但仍表現出很好的還原能力。

3 結論

試驗采用酶法提取水翁花中的黃酮類化合物，同時對其抗氧化活性進行評價。在單因素試驗的基礎上，利用響應面試驗設計和優化了總黃酮的提取工藝，獲得最佳工藝為：酶用量0.56%、酶解溫度56℃、酶解時間61 min、pH值4.9，總黃酮提取率為（3.85±0.09）%。抗氧化活性研究表明，當總黃酮溶液濃度為0.75 mg/mL時，其對ABTS+自由基的清除率達到（70.6±3.0）%，對ABTS+自由基的半數清除濃度IC50值為0.41 mg/mL；當濃度為1.6 mg/mL時，對油脂氧化的清除率為（58.7±2.4）%；當總黃酮溶液濃度為0.75 mg/mL時，測得700 nm處的吸光度值為（0.60±0.03），其還原力稍弱于BHT。試驗結果表明水翁花總黃酮提取液具有較好的抗氧化活性，可以為水翁花黃酮類化合物的開發利用提供理論依據和試驗數據。