響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料制備工藝及其抗氧化活性研究

李大成，韋巧艷，舒萬鑫，李英容，蔡吉祥

（廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546199）

甘蔗是喬本科的多年生草本植物，在我國(guó)廣西、廣東、云南等南方亞熱帶地區(qū)廣泛種植。甘蔗含糖量高，而且富含人體容易缺乏的多種微量元素，其中鐵元素的含量居水果之首，因此甘蔗常被人們稱作“補(bǔ)血果”和“鐵桿莊稼”[1-3]。隨著人們生活水平的提高及對(duì)健康生活的追求，人們對(duì)天然飲料的需求也日漸增加。甘蔗汁中含有豐富的多酚及黃酮類物質(zhì)，具有較好的抗氧化、抗炎和抗突變能力[4-5]。但是目前國(guó)內(nèi)的甘蔗汁主要用于生產(chǎn)白砂糖，甘蔗制糖行業(yè)存在著產(chǎn)品單一的問題，限制了制糖行業(yè)的發(fā)展。

桑葚（mulberry）又名桑葚子、桑果、烏椹等，是蕁麻目桑科桑屬植物桑樹的果穗。桑葚不僅含有人體所需的必需氨基酸和各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及調(diào)節(jié)免疫等功效，被國(guó)家衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的“藥食同源”的農(nóng)產(chǎn)品之一[6-8]。但桑葚采摘期短、水分高、屬于漿果類。不耐壓、容易腐爛變質(zhì)、不易貯藏和運(yùn)輸，一旦變質(zhì)就會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。目前以甘蔗汁和桑葚汁為原料進(jìn)行調(diào)配制備具有保健功效的桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以甘蔗汁和桑葚汁為主要原料，加入茉莉花茶湯調(diào)節(jié)其風(fēng)味，制備出一種新型的綠色保健型飲料。該試驗(yàn)不僅可以為甘蔗的綜合利用提供新的途徑，提高甘蔗及桑葚的附加值，同時(shí)可以有效地解決桑葚貯藏保鮮時(shí)間短的問題，為蔗汁復(fù)合飲料的研究開發(fā)提供必要的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)所需儀器型號(hào)及生產(chǎn)廠家見表1。

表1 儀器Table 1 The instrument

1.2 材料與試劑

試驗(yàn)所用材料與試劑見表2。

表2 試劑Table 2 Material

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 甘蔗汁的制備

取甘蔗濃縮汁25 g，定容到100 mL，混合均勻后備用。

1.3.2.2 桑葚汁及茉莉花茶湯的制備

取桑葚濃縮汁6.7 g，定容到100 mL，混合均勻后備用；取茉莉花茶3 g于燒杯中浸泡，按料液比1∶40（g/mL）加入蒸餾水，在85℃水浴鍋中浸提10 min，冷卻、過濾得到茉莉花茶湯[9]。

1.3.3 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料單因素試驗(yàn)

以桑葚-甘蔗汁體積比3∶4、檸檬酸添加量1.5%、維生素C添加量4%、茉莉花茶湯添加量35%為固定工藝參數(shù)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察桑葚-甘蔗汁體積比（1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1）、檸檬酸添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、維生素 C添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、茉莉花茶湯添加量（20%、25%、30%、35%、40%）4個(gè)主要影響因素對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料口感的影響。

1.4 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》的相關(guān)規(guī)定，總分以100分記，各項(xiàng)所占比例為色澤∶氣味∶口感∶組織狀態(tài)=2∶3∶3∶2，篩選出 10 名成員組成評(píng)價(jià)小組，制定感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)復(fù)合飲料進(jìn)行評(píng)分，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置評(píng)價(jià)環(huán)境。

表3 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criteria of mulberry-sugarcane juice complex beverage

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的配制

依據(jù)單因素試驗(yàn)確定不同因素的影響范圍，以桑葚-甘蔗汁體積比、檸檬酸添加量、維生素C添加量和茉莉花茶湯添加量為考察對(duì)象，感官評(píng)分作為響應(yīng)值，采用Design Expert8.0.6方法設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見表4。

表4 響應(yīng)面因素水平Table 4 Response surface factor level

1.6 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別量取4 mL不同濃度梯度的桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料和0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，充分混勻后放置在陰暗處靜置30 min，檢測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值A(chǔ)1，同時(shí)用乙醇作空白對(duì)照組，吸光度值記為A0，取4 mL復(fù)合飲料和4 mL乙醇溶液混勻按上述方法測(cè)定吸光值記為A2[10-11]。以抗壞血酸作為對(duì)照組，無水乙醇調(diào)零，重復(fù)3次取平均值。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下[12]。

1.6.2 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確量取不同濃度梯度的桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料1 mL，依次分別加入2 mL 9.9 mmol/L FeSO4·7H2O、9.9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L過氧化氫溶液于比色管中定容至10 mL，于37℃水浴反應(yīng)30 min，測(cè)定其在510 nm波長(zhǎng)下的吸光度值A(chǔ)x1[13-15]，以蒸餾水作參比，510 nm下測(cè)吸光值記為Ax0，量取不同濃度梯度的桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料1 mL，2 mL的9.9 mmol/L FeSO4·7H2O、9.9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液于比色管中定容至10 mL，按上述方法測(cè)定其吸光度值A(chǔ)x2。以抗壞血酸作為對(duì)照組，重復(fù)3次取平均值。羥基自由基清除率的計(jì)算公式[16]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2016、Origin 2018和Design-Expert 8.0.6進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚-甘蔗汁體積比對(duì)復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

在檸檬酸添加量1.5%、維生素C添加量4%、茉莉花茶湯添加量35%的條件下，以蔗汁-桑葚體積比為變量，制備桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料，考察桑葚-甘蔗汁體積比對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 桑葚汁和甘蔗汁體積比對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of the volume ratio of mulberry juice to sugarcane juice on sensory evaluation of compound beverage

由圖1可知，當(dāng)桑葚-甘蔗汁體積比在3∶4時(shí)，感官評(píng)分最高，為90.63分，口感酸甜適中，兼具兩者風(fēng)味，色澤透亮。甘蔗汁口感甜膩，桑葚汁口感偏酸澀，甘蔗汁比例較高時(shí)，甘蔗風(fēng)味濃郁，但糖分含量會(huì)偏高，口感過于甜膩；桑葚汁比例較高時(shí)，桑葚風(fēng)味過重，口感微甜偏酸澀，且顏色呈紫黑色，感官上不易被消費(fèi)者接受，感官評(píng)分偏低。因此選擇最佳桑葚-甘蔗汁體積比為 3∶4。

2.2 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

在桑葚-甘蔗汁體積比3∶4、維生素C添加量4%、茉莉花茶湯添加量35%的條件下，以檸檬酸添加量為變量，制備桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料，考察檸檬酸添加量對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of citric acid on sensory evaluation of compound beverage

檸檬酸作為抑菌劑和調(diào)節(jié)劑，具有降低飲料的pH值、抑制微生物繁殖，促進(jìn)纖維素和鈣、磷等物質(zhì)溶解的作用[17]，但是檸檬酸呈酸味，對(duì)飲料風(fēng)味和口感都有影響。由圖2可知，檸檬酸添加量為1.5%時(shí)感官評(píng)分最高達(dá)到89.97分，在大于1.5%時(shí)，其感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。檸檬酸的添加量要達(dá)到一定量才具備抑菌和調(diào)節(jié)飲料口感的作用，但是添加量超過1.5%時(shí)，檸檬酸的酸味特性較為突顯，飲料口感偏酸，掩蓋甘蔗和桑葚的風(fēng)味，導(dǎo)致復(fù)合飲料風(fēng)味較差。因此選擇最佳檸檬酸添加量為1.5%。

2.3 維生素C添加量對(duì)復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

在桑葚-甘蔗汁體積比3∶4、檸檬酸添加量1.5%、茉莉花茶湯添加量35%的條件下，以維生素C添加量為變量，制備桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料，考察維生素C添加量對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 維生素C添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of vitamin C supplementation on sensory evaluation of compound beverages

維生素C具有防止飲料發(fā)生褐變和營(yíng)養(yǎng)成分損失的作用[18]，由圖3可知，當(dāng)維生素C添加量增大到4%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高90.1分，當(dāng)維生素C小于4%時(shí)，復(fù)合飲料的顏色比較偏紫黑色，感官上不易被接受；而當(dāng)維生素C添加量超過4%后，則會(huì)導(dǎo)致飲料的pH值降低，不能夠遮蓋桑葚的苦澀味，還改變了飲料的風(fēng)味[19-21]，導(dǎo)致復(fù)合飲料的感官評(píng)價(jià)值下降。因此選擇最佳維生素C添加量為4%。

2.4 茉莉花茶湯添加量對(duì)復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

在桑葚-甘蔗汁體積比3∶4、檸檬酸添加量1.5%、維生素C添加量4%的條件下，以茉莉花茶湯添加量為變量，制備桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料，考察茉莉花茶湯添加量對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 茉莉花茶湯添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of adding amount of jasmine tea soup on sensory evaluation of compound beverage

由圖4可知，當(dāng)茉莉花茶添加量在20%～40%時(shí)，其感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)茉莉花茶湯的添加量為35%時(shí)，感官評(píng)分最高達(dá)到91分，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的酸甜口感適中，風(fēng)味香氣適宜。

茉莉花茶湯可以賦予飲料清新的香氣，調(diào)節(jié)和掩蓋桑葚、甘蔗汁的苦澀味。茉莉花湯過多，茉莉花香氣完全掩蓋桑葚、甘蔗的特殊風(fēng)味，導(dǎo)致口感不適宜飲用；茉莉花茶湯過少，茉莉花香氣無法中和甘蔗汁的甜膩，也無法掩蓋桑葚汁的酸澀味，導(dǎo)致各種風(fēng)味無法融合，口感復(fù)雜，感官評(píng)價(jià)得分較低。因此選擇最佳茉莉花茶湯的添加量為35%。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果如表5所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

對(duì)表5進(jìn)行擬合回歸，得到桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料感官評(píng)分與各因素變量（A桑葚-甘蔗汁體積比、B檸檬酸添加量、C維生素C添加量、D茉莉花茶湯添加量、Y感官評(píng)分）之間的二元回歸方程：Y=91.4+2.947A-2.43B-0.8C-1.858D-9.888A2-9.25B2-4.925C2-7.463D2+2.275AC+2.875AD-0.725AB+2.125BC+2.9BD。

進(jìn)一步對(duì)表5試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鯰able 6 Box-behnken experimental model analysis of variance

由表6可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲顦O顯著（p<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.123 4>0.05），因此該模型可以反映各因素對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的影響。該回歸模型的決定系數(shù)R2=0.973 7，R2Adj=0.947 3，說明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)值的擬合度程度較高，進(jìn)一步說明該回歸方程可以對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的感官評(píng)價(jià)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由F值可知各因素對(duì)響應(yīng)值影響的主次順序?yàn)椋篈桑葚-甘蔗汁體積比>B檸檬酸添加量>D茉莉花茶湯添加量>C維生素C添加量。影響感官評(píng)分的因素中，一次項(xiàng) A、B，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2都是極顯著水平（p<0.01），而一次項(xiàng)D以及交互項(xiàng)AD、BD是顯著水平（p<0.05），而其他結(jié)果影響不顯著（p>0.05）。

各因素之間的交互作用可以由響應(yīng)面直接反映，橢圓形等高線表示兩個(gè)因素間的交互作用明顯，圓形表示兩因素間的交互作用不明顯[22]。根據(jù)二元回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖，結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 茉莉花茶湯添加量與桑葚-甘蔗汁體積比對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的等高線及響應(yīng)值Fig.5 Contour line and response value of sensory score of compound beverage by adding amount of jasmine tea soup and mulberries-sugarcane juice volume ratio

圖6 檸檬酸添加量與茉莉花茶湯添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的等高線及響應(yīng)值Fig.6 Contour line and response value of adding amount of citric acid and jasmine tea soup to sensory score of compound beverage

由圖5、圖6可以看出，AD、BD的交互作用對(duì)復(fù)合飲料的感官評(píng)價(jià)值具有顯著影響，而其他的交互作用都不顯著，且圖5、圖6的三維立體圖響應(yīng)面的開口朝下，表明響應(yīng)面具有最大值，在試驗(yàn)范圍內(nèi)有最優(yōu)配方。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程分析，得到的最優(yōu)響應(yīng)面結(jié)果為：桑葚-甘蔗汁體積比為3：4，檸檬酸添加量1.4%，維生素C添加量4%，茉莉花茶湯添加量34.27%，對(duì)應(yīng)的感官評(píng)分為91.877 6分。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整茉莉花茶湯添加量為34%，在此條件下進(jìn)行飲料復(fù)配得到的感官評(píng)分值的平均值為90.72分，與預(yù)測(cè)值相接近，故該響應(yīng)面優(yōu)化模型所得到的工藝參數(shù)的可靠性高。

2.6 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基清除能力分析

以抗壞血酸作為對(duì)照組，考察桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of compound beverage on DPPH free radical

圖8 抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.8 The scavenging effect of ascorbic acid on DPPH free radical

由圖7可知，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的濃度在0.2g/L～1.8g/L的范圍內(nèi)，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)DPPH自由基清除能力隨著溶液濃度增大而提高。通過線性擬合得到桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的溶液質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的線性方程是：y=0.422 5x+0.041（R2=0.998 1），IC50=1.086 g/L。由圖8可知，抗壞血酸的溶液的質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的線性方程為：y=31.75x-0.1099（R2=0.9929），IC50=0.019 g/L。桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的質(zhì)量濃度在料濃度在1.8 g/L時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到78.93%，表明復(fù)合飲料具有抗氧化性，但其清除DPPH自由基的能力比抗壞血酸的弱。

2.7 桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)羥基自由基清除能力分析

以抗壞血酸作為對(duì)照組，考察桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)羥基自由基清除能力。結(jié)果如圖9、圖10所示。

圖9 復(fù)合飲料對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.9 The scavenging effect of compound beverage on hydroxyl radical

圖10 抗壞血酸的羥基自由基的清除效果Fig.10 Scavenging effect of hydroxyl radical of ascorbic acid

由圖9可知，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的濃度在15g/L～75 g/L的范圍內(nèi)，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料對(duì)羥基自由基清除能力隨著溶液濃度增大而提高。通過線性擬合得到桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的溶液質(zhì)量濃度與羥基自由基清除率的線性方程是：y=0.011 2x+0.048 7（R2=0.986 1），IC50=40.29 g/L。由圖10可知，抗壞血酸的溶液濃度與羥基自由基清除率的線性方程是：y=0.349 3x-0.032 5（R2=0.996 6），IC50=1.52 g/L。桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的質(zhì)量濃度在料濃度在80 g/L時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)到87.74%，表明復(fù)合飲料具有抗氧化性，但其清除羥基自由基的能力比抗壞血酸的弱。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法，對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明最佳配方為：桑葚汁和甘蔗汁體積比為3∶4，檸檬酸添加量為1.4%，茉莉花茶湯添加量為34%，維生素C添加量為4%，在此條件下，桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料的感官評(píng)價(jià)得分為90.72分，此時(shí)復(fù)合飲料的色澤呈現(xiàn)紫紅色，酸甜適中，帶有濃濃的茉莉花茶的香氣。在此最優(yōu)條件下，對(duì)桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲料進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明桑葚-甘蔗汁復(fù)合飲對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力。