Trk-B在促進膠質母細胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機制研究

林賢賓

（福建醫科大學附屬第二醫院，福建 泉州 362000）

膠質母細胞瘤是中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤，根據世界衛生組織神經系統病理可以將膠質母細胞瘤核分裂活躍程度以及臨床預后情況分為WHOⅠ、WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣ4個級別[1]。其中膠質母細胞瘤WHOⅢ、WHOⅣ級較WHOⅠ、WHOⅡ級膠質瘤增殖明顯活躍，核分裂相增多，復發率較高。目前主要治療方法包括手術、放療、化療等，均有一定的效果，但對于高級別膠質母細胞瘤預后效果并不理想。因此，研究惡性膠質母細胞瘤增殖的分子病理機制，對于理解膠質母細胞瘤的惡性生物學行為具有重要意義，并且可為惡性膠質母細胞瘤的分子靶向治療提供理想可靠的治療靶標，為臨床上干預惡性膠質母細胞瘤的發生發展提供堅實的實驗依據。相關研究[2]發現，Trk-B可能與NOgo受體復合物在膠質母細胞瘤中存在拮抗作用，能夠導致腫瘤細胞快速增長。本文旨在探討Trk-B在促進膠質母細胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機制，為臨床干預惡性膠質母細胞瘤發生發展提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇4～6周齡雌性膠質母細胞瘤Balb/c裸鼠24只進行研究，將其分為3組，即Trk-B組、對照組、穩定敲低組，每組8只。

1.2 方法 分別將Trk-B過表達細胞、野生型細胞和穩定敲低的Trk-B單細胞懸液注入右側腋部皮下，比較不同組間腫瘤生長情況。觀察終點應用qRT-PCR、免疫組化檢測腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達。應用蛋白免疫印跡檢測腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達。將未處理細胞移植瘤采用插塊法再次接種至裸鼠皮下，分為3組，每組8只，腫瘤長至300 mm3進行干預：空白組、Nogo激活劑和抑制劑治療組（3組）予以處理。

Trk-B組：Trk-B過表達細胞注射右側腋部皮下。對照組：野生型細胞注射右側腋部皮下。穩定敲低組：穩定敲低的Trk-B單細胞懸液注射右側腋部皮下。干預后28 d處死荷瘤裸鼠，觀察腫瘤生長抑制率，應用免疫組化檢測腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達情況應用蛋白免疫印跡檢測腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達。在臨床檢測期間，首先進行單層貼壁細胞總蛋白的提取，在提取完成后，對組織中總蛋白進行提取，并將已加藥物處理后的貼壁細胞總蛋白進行提取。在實際提取過程中，首先需要將培養液導入至離心管中，在2500 rpm狀態下離心5 min，去除上清液后對其進行吹打洗滌，繼續在2500 rpm狀態下離心5 min，棄上清液后使用PBS進行1次重復洗滌。加入100 μL裂解液實施30 min的冰上裂解處理，并將裂解液混合后，于12000 rpm狀態下離心5 min，裝于0.5 mL的離心管中，在-20 ℃下保存。將提取完成后的蛋白含量進行測定，首先取1.5 mL離心管，加入4 ℃的考馬斯亮藍溶液1 mL，在室溫放置30 min后進行蛋白含量測量。

1.3 評價標準 對比3組細胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉移率以及裸鼠預后情況。

1.4 統計學方法 將數據納入SPSS20.0軟件中進行統計學分析，計量資料比較采用t檢驗，并以（）表示，計數資料采用χ2檢驗，并以（n，%）表示，P＜0.05為差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 3組細胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉移率比較 研究結果顯示，Trk-B組的細胞凋亡率明顯低于對照組和穩定敲低組，Trk-B組腫瘤體積、腫瘤轉移率均明顯高于對照組和穩定敲低組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組細胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉移率比較（）

表1 3組細胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉移率比較（）

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與對照組比較，P＜0.05。

2.2 3組裸鼠預后情況分析 Trk-B組WHOⅢ級和WHOⅣ級共6 例（75.00%）、對照組WHO Ⅲ級和WHO Ⅳ級共3例（37.50%）、穩定敲低組WHOⅢ級和WHOⅣ級共2例（25.00%）。由此可見，Trk-B組WHOⅢ級和WHOⅣ級明顯高于對照組和穩定敲低組（χ2=28.571、50.000，均P＜0.001）。

3 討論

膠質母細胞瘤來源于上皮腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，統稱為腦膠質母細胞瘤，也是最為常見的原發性顱內腫瘤。根據相關研究發現，膠質母細胞瘤年發病率為3～8人/10萬人。目前對于高級別膠質母細胞瘤預后情況并未得到有效改善，因此還需要臨床不斷深入探討。細胞凋亡是機體生長、分化、發育和病理過程中，由基因編碼調控的細胞自發死亡過程，又稱程序性死亡[3]。正常的上皮或內皮細胞具有黏附依賴性，其存活依賴于細胞間和細胞與基質間的信號傳遞，稱為錨定依賴。正常上皮細胞或不具備轉移性質的實體瘤細胞從原位脫落進入血流后就會引發細胞凋亡，這種在脫離原來生存環境的特殊情況下發生的細胞凋亡稱為失巢凋亡[4]。失巢凋亡作為一種特殊的程序化細胞死亡形式，在機體發育、組織自身平衡、疾病發生和腫瘤轉移中起重要作用。腫瘤細胞，尤其是一些容易發生遠處轉移的惡性腫瘤細胞，具有極強的抗失巢凋亡特性，從瘤體上脫落進入循環系統后并不發生凋亡，從而完成轉移過程。惡性腫瘤的這種抗失巢凋亡特性已經在肺癌、腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、口腔鱗狀細胞癌等癌細胞體外培養實驗中得到了證實，逐步揭示了失巢凋亡的分子機制[5]。失巢凋亡通過傳統的細胞凋亡途徑誘導細胞死亡，整合蛋白感知和傳導細胞外基質信號而控制細胞的黏附和存活，Bcl-2和某些Bcl-2相關蛋白廣泛參與細胞失巢凋亡的調節，多種蛋白激酶信號分子參與失巢凋亡的信號轉導[6]。

Trk-B是一種抑制失巢凋亡和誘導腫瘤轉移的蛋白，即酪氨酸激酶受體，為失巢凋亡抑制與腫瘤惡性浸潤性的關系提供了實驗依據[7]。利用基因轉染技術培養出高表達Trk-B的小腸上皮細胞，當用這些轉染的非腫瘤性細胞進行小鼠鼠尾靜脈注射后，小腸上皮細胞在小鼠的肺、肝、腎、心和骨骼迅速形成腫瘤，而注射對照細胞的小鼠均沒有腫瘤出現。高表達Trk-B的細胞能夠在脫離基質的情況下形成細胞團，通過血管等達到遠處轉移的目的。有研究表明，Trk-B在膠質母細胞瘤細胞的惡性增殖中起到關鍵作用，然而在膠質母細胞瘤細胞中，Trk-B是否通過失巢凋亡抵抗來實現細胞惡性增殖目前還沒有相關報道[8]。此次研究Trk-B與AKT在膠質母細胞瘤細胞惡性增殖相互關系為切入點，在前期研究工作基礎上，提出Trk-B與Nogo受體復合物可能通過調控惡性膠質母細胞瘤細胞失巢凋亡抵抗，促使惡性膠質母細胞瘤細胞增殖和轉移實驗設想，對膠質母細胞瘤細胞的惡性增殖分子病理機制進行深入探索，目前國內外尚無類似文獻報道。當前在我國的研究中已經熟練掌握研究所需的實驗技能如免疫組化、PCR、質粒構建和轉染、RNAi、Western Blot等，在顱腦腫瘤相關分子靶標篩選和功能鑒定方面做了大量工作，積累了豐富的經驗，能夠保證研究順利進行。本研究通過對Trk-B促進膠質母細胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機制進行分析，發現Trk-B組的細胞凋亡率明顯低于對照組和穩定敲低組，腫瘤體積、腫瘤轉移率、WHOⅢ級和WHOⅣ級明顯高于對照組和穩定敲低組（P＜0.05）。證明了Trk-B通過拮抗Nogo受體調控AKT表達，參與膠質母細胞瘤細胞惡性增殖和失巢凋亡抵抗的分子機制及其與膠質母細胞瘤細胞惡性表型的聯系，可能為臨床上提供潛在的分子靶標并為惡性膠質母細胞瘤的分子干預提供初步實驗依據。劉學鍵等[9]研究發現，Trk-B能夠通過促進膠質母細胞瘤失巢凋亡抵抗，導致病灶增殖和轉移；胡克琦等[10]研究發現，Trk-B能夠促進膠質母細胞失巢凋亡抵抗，均與本研究結果相似。總之，Trk-B會通過促進膠質母細胞瘤失巢凋亡抵抗，導致病灶增殖和轉移。