Trk-B在促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機(jī)制研究

林賢賓

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織神經(jīng)系統(tǒng)病理可以將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤核分裂活躍程度以及臨床預(yù)后情況分為WHOⅠ、WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣ4個(gè)級(jí)別[1]。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤WHOⅢ、WHOⅣ級(jí)較WHOⅠ、WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤增殖明顯活躍，核分裂相增多，復(fù)發(fā)率較高。目前主要治療方法包括手術(shù)、放療、化療等，均有一定的效果，但對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后效果并不理想。因此，研究惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖的分子病理機(jī)制，對(duì)于理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)行為具有重要意義，并且可為惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子靶向治療提供理想可靠的治療靶標(biāo)，為臨床上干預(yù)惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相關(guān)研究[2]發(fā)現(xiàn)，Trk-B可能與NOgo受體復(fù)合物在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在拮抗作用，能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞快速增長。本文旨在探討Trk-B在促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機(jī)制，為臨床干預(yù)惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇4～6周齡雌性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Balb/c裸鼠24只進(jìn)行研究，將其分為3組，即Trk-B組、對(duì)照組、穩(wěn)定敲低組，每組8只。

1.2 方法 分別將Trk-B過表達(dá)細(xì)胞、野生型細(xì)胞和穩(wěn)定敲低的Trk-B單細(xì)胞懸液注入右側(cè)腋部皮下，比較不同組間腫瘤生長情況。觀察終點(diǎn)應(yīng)用qRT-PCR、免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達(dá)。應(yīng)用蛋白免疫印跡檢測(cè)腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達(dá)。將未處理細(xì)胞移植瘤采用插塊法再次接種至裸鼠皮下，分為3組，每組8只，腫瘤長至300 mm3進(jìn)行干預(yù)：空白組、Nogo激活劑和抑制劑治療組（3組）予以處理。

Trk-B組：Trk-B過表達(dá)細(xì)胞注射右側(cè)腋部皮下。對(duì)照組：野生型細(xì)胞注射右側(cè)腋部皮下。穩(wěn)定敲低組：穩(wěn)定敲低的Trk-B單細(xì)胞懸液注射右側(cè)腋部皮下。干預(yù)后28 d處死荷瘤裸鼠，觀察腫瘤生長抑制率，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達(dá)情況應(yīng)用蛋白免疫印跡檢測(cè)腫瘤組織中Trk-B、Nogo受體和AKT的表達(dá)。在臨床檢測(cè)期間，首先進(jìn)行單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取，在提取完成后，對(duì)組織中總蛋白進(jìn)行提取，并將已加藥物處理后的貼壁細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取。在實(shí)際提取過程中，首先需要將培養(yǎng)液導(dǎo)入至離心管中，在2500 rpm狀態(tài)下離心5 min，去除上清液后對(duì)其進(jìn)行吹打洗滌，繼續(xù)在2500 rpm狀態(tài)下離心5 min，棄上清液后使用PBS進(jìn)行1次重復(fù)洗滌。加入100 μL裂解液實(shí)施30 min的冰上裂解處理，并將裂解液混合后，于12000 rpm狀態(tài)下離心5 min，裝于0.5 mL的離心管中，在-20 ℃下保存。將提取完成后的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，首先取1.5 mL離心管，加入4 ℃的考馬斯亮藍(lán)溶液1 mL，在室溫放置30 min后進(jìn)行蛋白含量測(cè)量。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比3組細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率以及裸鼠預(yù)后情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將數(shù)據(jù)納入SPSS20.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，并以（）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，并以（n，%）表示，P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率比較 研究結(jié)果顯示，Trk-B組的細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組和穩(wěn)定敲低組，Trk-B組腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率均明顯高于對(duì)照組和穩(wěn)定敲低組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率比較（）

表1 3組細(xì)胞凋亡率、腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率比較（）

注：a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.2 3組裸鼠預(yù)后情況分析 Trk-B組WHOⅢ級(jí)和WHOⅣ級(jí)共6 例（75.00%）、對(duì)照組WHO Ⅲ級(jí)和WHO Ⅳ級(jí)共3例（37.50%）、穩(wěn)定敲低組WHOⅢ級(jí)和WHOⅣ級(jí)共2例（25.00%）。由此可見，Trk-B組WHOⅢ級(jí)和WHOⅣ級(jí)明顯高于對(duì)照組和穩(wěn)定敲低組（χ2=28.571、50.000，均P＜0.001）。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源于上皮腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，統(tǒng)稱為腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，也是最為常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤年發(fā)病率為3～8人/10萬人。目前對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后情況并未得到有效改善，因此還需要臨床不斷深入探討。細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長、分化、發(fā)育和病理過程中，由基因編碼調(diào)控的細(xì)胞自發(fā)死亡過程，又稱程序性死亡[3]。正常的上皮或內(nèi)皮細(xì)胞具有黏附依賴性，其存活依賴于細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的信號(hào)傳遞，稱為錨定依賴。正常上皮細(xì)胞或不具備轉(zhuǎn)移性質(zhì)的實(shí)體瘤細(xì)胞從原位脫落進(jìn)入血流后就會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡，這種在脫離原來生存環(huán)境的特殊情況下發(fā)生的細(xì)胞凋亡稱為失巢凋亡[4]。失巢凋亡作為一種特殊的程序化細(xì)胞死亡形式，在機(jī)體發(fā)育、組織自身平衡、疾病發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤細(xì)胞，尤其是一些容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞，具有極強(qiáng)的抗失巢凋亡特性，從瘤體上脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后并不發(fā)生凋亡，從而完成轉(zhuǎn)移過程。惡性腫瘤的這種抗失巢凋亡特性已經(jīng)在肺癌、腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌等癌細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)，逐步揭示了失巢凋亡的分子機(jī)制[5]。失巢凋亡通過傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，整合蛋白感知和傳導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)而控制細(xì)胞的黏附和存活，Bcl-2和某些Bcl-2相關(guān)蛋白廣泛參與細(xì)胞失巢凋亡的調(diào)節(jié)，多種蛋白激酶信號(hào)分子參與失巢凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。

Trk-B是一種抑制失巢凋亡和誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白，即酪氨酸激酶受體，為失巢凋亡抑制與腫瘤惡性浸潤性的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[7]。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)培養(yǎng)出高表達(dá)Trk-B的小腸上皮細(xì)胞，當(dāng)用這些轉(zhuǎn)染的非腫瘤性細(xì)胞進(jìn)行小鼠鼠尾靜脈注射后，小腸上皮細(xì)胞在小鼠的肺、肝、腎、心和骨骼迅速形成腫瘤，而注射對(duì)照細(xì)胞的小鼠均沒有腫瘤出現(xiàn)。高表達(dá)Trk-B的細(xì)胞能夠在脫離基質(zhì)的情況下形成細(xì)胞團(tuán)，通過血管等達(dá)到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的。有研究表明，Trk-B在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性增殖中起到關(guān)鍵作用，然而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，Trk-B是否通過失巢凋亡抵抗來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞惡性增殖目前還沒有相關(guān)報(bào)道[8]。此次研究Trk-B與AKT在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性增殖相互關(guān)系為切入點(diǎn)，在前期研究工作基礎(chǔ)上，提出Trk-B與Nogo受體復(fù)合物可能通過調(diào)控惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗，促使惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)設(shè)想，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性增殖分子病理機(jī)制進(jìn)行深入探索，目前國內(nèi)外尚無類似文獻(xiàn)報(bào)道。當(dāng)前在我國的研究中已經(jīng)熟練掌握研究所需的實(shí)驗(yàn)技能如免疫組化、PCR、質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染、RNAi、Western Blot等，在顱腦腫瘤相關(guān)分子靶標(biāo)篩選和功能鑒定方面做了大量工作，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，能夠保證研究順利進(jìn)行。本研究通過對(duì)Trk-B促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤失巢凋亡抵抗中的作用及機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Trk-B組的細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組和穩(wěn)定敲低組，腫瘤體積、腫瘤轉(zhuǎn)移率、WHOⅢ級(jí)和WHOⅣ級(jí)明顯高于對(duì)照組和穩(wěn)定敲低組（P＜0.05）。證明了Trk-B通過拮抗Nogo受體調(diào)控AKT表達(dá)，參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性增殖和失巢凋亡抵抗的分子機(jī)制及其與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性表型的聯(lián)系，可能為臨床上提供潛在的分子靶標(biāo)并為惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子干預(yù)提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。劉學(xué)鍵等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Trk-B能夠通過促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤失巢凋亡抵抗，導(dǎo)致病灶增殖和轉(zhuǎn)移；胡克琦等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Trk-B能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞失巢凋亡抵抗，均與本研究結(jié)果相似?？傊?，Trk-B會(huì)通過促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤失巢凋亡抵抗，導(dǎo)致病灶增殖和轉(zhuǎn)移。