梔子總環(huán)烯醚萜對(duì)抑郁模型小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

曲書閱衡 霞戚懿予葛平原楊念云朱華旭茅向軍張啟春

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng)550025； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省植物藥深加工工程中心，江蘇 南京210023； 4.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥藥效與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210023； 5.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng)550004）

抑郁癥是一種由生物學(xué)、心理、遺傳、社會(huì)和家庭因素引發(fā)的疾病，主要表現(xiàn)為自卑、快感不足、無價(jià)值感、自殺念頭等癥狀［1］，并具有易發(fā)病、易致殘、易反復(fù)的特點(diǎn)［2］。臨床上以西藥治療為主，但有不良反應(yīng)、依從性差、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)［3］。因此，越來越多的研究人員將目光投向于中草藥，中藥成分多、靶點(diǎn)多、作用多的優(yōu)點(diǎn)，在藥物開發(fā)和臨床治療中具有良好的應(yīng)用前景［4］。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及炎癥因子有關(guān)。神經(jīng)遞質(zhì)在突觸傳遞中是充當(dāng)“信使”的特定化學(xué)物質(zhì)，對(duì)維持人體正常的生理活動(dòng)具有重要作用［5］，其含量和受體功能的變化可導(dǎo)致抑郁的發(fā)生，主要包括單胺類、氨基酸類和膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)。

梔子為茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒的作用。總環(huán)烯醚萜作為梔子的主要活性成分，具有抗抑郁、抗炎和保護(hù)細(xì)胞等作用［6］。研究表明，梔子苷抗抑郁的作用機(jī)制可能與小鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺水平升高有關(guān)［7］。但目前總環(huán)烯醚萜對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)遞質(zhì)的時(shí)程性變化還有待研究，因此我們建立了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型，探討脂多糖作用后2、6、12、24 h 對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響以及小鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由青龍山動(dòng)物繁殖中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2019?0009。在24 h 的明暗周期中自由飲食飲水，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度為（60±5）%。

1.2 藥物與試劑 梔子（產(chǎn)地江西，批號(hào)160501），購(gòu)自安徽中州中藥飲片有限公司，經(jīng)生藥學(xué)教授吳啟楠博士鑒定（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院）為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesJ.Ellis 的干燥成熟果實(shí)。對(duì)照品γ?氨基丁酸（GABA，批號(hào)100482?201601）、氯化乙酰膽堿（ACh，批號(hào)111597?200331）、鹽酸多巴胺（DA，批 號(hào)100070?201507）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；L?谷氨酸（Glu，批號(hào)111576?200201）、5?羥色胺鹽酸鹽（5?HT，批號(hào) 111656?200401 ）、梔子苷（純 度 98%，批 號(hào)FY18380711）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma 公司）；鹽酸氟西汀（北京伊諾凱科技有限公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)默克公司）；甲酸（色譜級(jí)，阿拉丁）；羧甲基纖維素鈉（CMC?Na，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（江蘇花廳生物科技有限公司）；AB?8型和HPD100 型大孔吸附樹脂（南京良緯生物科技有限公司）；純水和超純水均為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀AB Q?Trap 5500（美國(guó)AB SCIEX 公司）；Analyst 分析軟件（美國(guó)AB SCIEX 公司）；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；冷凍干燥系統(tǒng)（南京新飛達(dá)光電科學(xué)技術(shù)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（南京金正教學(xué)儀器有限公司）；實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水儀（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（南京百奧生物科技有限公司）；全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）。

2 方法

2.1 總環(huán)烯醚萜的提取和純化 稱取梔子500 g，先加5 L水回流提取1.5 h，再加4 L 水回流提取1 h。用紗布過濾后合并濾液，常壓濃縮至生藥濃度為0.2 g／mL 的梔子水提濃縮液。將此溶液過HPD100 和AB?8（2 ∶1）混合型大孔吸附樹脂柱，大孔吸附樹脂柱的徑高比為1 ∶10，洗脫體積流量1.5 mL／min，先用2 BV 蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫至無色，得到總環(huán)烯醚萜洗脫液［8］。將洗脫液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后放入冷凍干燥機(jī)中凍干，得到總環(huán)烯醚萜凍干粉32.79 g。

2.2 總環(huán)烯醚萜含有量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品2.72 mg，用甲醇溶解配制成0.054 4 mg／mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 定容于5 mL量瓶中，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以甲醇為參比溶液，用紫外可見分光光度計(jì)于238 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液的濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程Y＝27.359X＋0.017，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

2.2.2 含有量測(cè)定結(jié)果 精密稱取總環(huán)烯醚萜凍干粉3.21 mg，用甲醇溶解于25 mL 量瓶中，再準(zhǔn)確吸取2 mL溶液定容于50 mL 量瓶中，得到供試品溶液。用紫外可見分光光度計(jì)于238 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定該溶液的吸光度為0.626，求得溶液質(zhì)量濃度為0.022 26 mg／mL，總環(huán)烯醚萜含量為86.68%。

2.3 造模、分組與給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為10 組，每組10 只，分別是對(duì)照組、鹽酸氟西汀組（2 h?LPS＋鹽酸氟西汀組，20 mg／kg）、4 個(gè)LPS 模型組（2 h?LPS 組、6 h?LPS 組、12 h?LPS 組、24 h?LPS 組）和4 個(gè)總環(huán)烯醚萜給藥組（2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組、6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組、12 h?LPS ＋環(huán)烯醚萜組、24 h?LPS ＋環(huán)烯醚萜組，90 mg／kg）。總環(huán)烯醚萜給藥組和鹽酸氟西汀組分別溶于0.5% CMC?Na 中，各組以0.2 mL／10 g 連續(xù)灌胃7 d，每天1 次，對(duì)照組和模型組給予0.5% CMC?Na 溶液。在最后一次給藥后1 h，對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余小鼠注射0.83 mg／kg LPS。LPS 注射2 h 后，對(duì)照組、2 h?LPS＋鹽酸氟西汀組、2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和2 h?LPS 組進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；LPS 注射6 h 后，6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS 組進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；LPS 注射12 h 后，12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和12 h?LPS 組進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；LPS 注射24 h 后，24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS 組進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。

2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入直徑約12 cm、高約25 cm的透明圓筒中，筒內(nèi)水深15 cm，水溫（25±1）℃，小鼠無法觸碰圓筒底部。用攝像頭記錄小鼠6 min 內(nèi)的游泳行為，并統(tǒng)計(jì)小鼠在后4 min 內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間［9］。

2.5 海馬處理 強(qiáng)迫游泳結(jié)束后，立即處死小鼠，冰上分離出海馬組織并于液氮中快速冷凍。精密稱取海馬組織，加入10 倍量冰冷的0.1% 甲酸，勻漿3 min。取勻漿液100 μL，加入冰冷的0.2% 甲酸?乙腈200 μL，渦旋振蕩3 min，在4 ℃冷凍離心機(jī)中12 000 r／min 離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入離心濃縮儀中濃縮揮干，0.1% 甲酸水復(fù)溶進(jìn)樣。

2.6 色譜條件 色譜柱InfinityLab Poroshell 120 EC?C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A 為乙腈，B 為0.1%甲酸；柱溫30 ℃；體積流量300 μL／min；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫（0～2 min，98%～95% B；2～3.5 min，95%～40% B；3.5～4 min，40%～98% B；4～6.1 min，98% B）。

2.7 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓30.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃。質(zhì)譜離子對(duì)信息見表1。

表1 神經(jīng)遞質(zhì)的質(zhì)譜信息

3 結(jié)果

3.1 總環(huán)烯醚萜對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 LPS 注射后，4 個(gè)模型組（2、6、12、24 h）小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組升高（P＜0.01），同時(shí)，陽(yáng)性藥鹽酸氟西汀也能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），表明造模成功。與模型LPS 組比較，2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組均能縮短小鼠不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無明顯變化（P＞0.05）。表明總環(huán)烯醚萜在LPS 注射后2～6 h 具有抗抑郁作用。見表2。

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的比較（， n＝10）

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的比較（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與2 h?LPS 組比較，＃＃P＜0.01；與6 h?LPS組比較，＆＆p＜0.01。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性范圍及定量限 精密稱取5 種神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)照品各2 mg，用0.1%甲酸溶解配制成1 mg／mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取5 種對(duì)照品儲(chǔ)備液各200 μL，加0.1% 甲酸至10 mL，配制成20 μg／mL 的混合對(duì)照品溶液，0.1%甲酸稀釋至5、10、50、100、200、400、500、1 000、2 500、10 000、20 000 ng／mL，各取2 μL 進(jìn)行LC?MS／MS 分析，并以各神經(jīng)遞質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。見表3。

表3 5 種神經(jīng)遞質(zhì)的線性關(guān)系及定量限

3.2.2 精密度試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度（100、500、2 500 ng／mL）的對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度6 份，每天測(cè)定3 次，連續(xù)3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果，GABA、Glu、DA、5?HT、ACh 的日內(nèi)精密度RSD≤6.06，日間精密度RSD≤6.52，符合分析要求，見表4。

表4 5 種神經(jīng)遞質(zhì)的精密度試驗(yàn)結(jié)果（）

表4 5 種神經(jīng)遞質(zhì)的精密度試驗(yàn)結(jié)果（）

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取低、中、高濃度的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃保存，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，各神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)照品RSD≤6.45%，表明4 ℃下24 h 內(nèi)對(duì)照品穩(wěn)定性較好。另取“2.5”項(xiàng)下的同一種腦組織的供試品溶液，于4 ℃保存，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，各腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)RSD≤6.0%，表明4 ℃下24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性較好。見表5。

表5 5 種神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)及加樣回收率（）

表5 5 種神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)及加樣回收率（）

3.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取空白腦組織勻漿液100 μL，加入已知量的各神經(jīng)遞質(zhì)混合對(duì)照品溶液，配制成100、500、2 500 ng／mL，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品數(shù)為6 份，按“2.5”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，記錄所測(cè)峰面積，用A表示。另取空白腦組織勻漿液6 份，每份100 μL，同法處理，離心取上清后分別加入與上述等濃度的混合對(duì)照品溶液，放入離心濃縮儀中濃縮揮干，0.1%甲酸復(fù)溶進(jìn)樣，記錄所測(cè)峰面積，用B表示，加樣回收率＝（A／B）×100%。結(jié)果見表5。

3.2.5 總環(huán)烯醚萜對(duì)海馬中神經(jīng)遞質(zhì)的影響 混合對(duì)照品及樣品中神經(jīng)遞質(zhì)色譜圖見圖1。與對(duì)照組相比，2 h?LPS組小鼠海馬區(qū)Glu、ACh 升高（P＜0.01），GABA、5?HT、DA 降低（P＜0.01）；與模型LPS 組相比，2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中Glu、ACh 降低（P＜0.01），2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中GABA、5?HT、DA 升高（P＜0.01），但12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中各神經(jīng)遞質(zhì)含量變化與模型組相比無明顯變化（P＞0.05）。見圖2～3。

圖1 混合對(duì)照品和海馬中各神經(jīng)遞質(zhì)色譜圖

圖2 總環(huán)烯醚萜對(duì)抑郁小鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的影響（n＝10）

圖3 總環(huán)烯醚萜對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響（n＝10）

4 討論

脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外壁的主要成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子［10］，炎性細(xì)胞因子通過影響腦中神經(jīng)傳遞而發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致抑郁癥［11］。脂多糖注射后會(huì)產(chǎn)生心情低落，體質(zhì)量減輕，食欲不振等癥狀，可用來模擬抑郁癥的行為絕望狀態(tài)［12］。本研究結(jié)果顯示，脂多糖注射后，模型組（2、6、12、24 h）小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，總環(huán)烯醚萜給藥后，2 h 和6 h 組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少，并與鹽酸氟西汀和對(duì)照組小鼠不動(dòng)時(shí)間相當(dāng)，說明LPS 注射后2～6 h 總環(huán)烯醚萜可以改善小鼠的抑郁樣行為。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)，人體情緒的改變與海馬組織密切相關(guān)［13］。在抑郁癥的發(fā)病過程中，海馬區(qū)功能受損，神經(jīng)遞質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生改變。而抗抑郁藥可以保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生［14］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦功能的正常運(yùn)行依賴于氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，Glu 經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧生成GABA，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性遞質(zhì)，具有神經(jīng)保護(hù)作用［15］，當(dāng)GABA 缺乏時(shí)會(huì)造成情緒失落［16］。Glu 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性遞質(zhì)，是腦內(nèi)含量最多的一種氨基酸。Glu 在正常情況下參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶等過程，但在病理狀態(tài)下表現(xiàn)出神經(jīng)毒性［17］。唐亞梅等通過慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)抑郁模型大鼠中Glu 水平升高［18］，通過調(diào)節(jié)Glu／GABA 的比值而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性遞質(zhì)，主要參與情感、睡眠、運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)［19］，其抗抑郁作用機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)的濃度及數(shù)量有關(guān)。研究表明抑郁模型大鼠可引起5?HT 和DA 含量下降［20］。膽堿能系統(tǒng)參與情緒調(diào)節(jié)，抑郁癥通常與膽堿類遞質(zhì)異常有關(guān)［21］。ACh 在運(yùn)動(dòng)、感覺、活動(dòng)、攝食、體溫調(diào)節(jié)、睡眠和學(xué)習(xí)記憶中都起著重要的作用，當(dāng)ACh 增多、釋放減少時(shí)，可出現(xiàn)活動(dòng)減少，嗜睡等現(xiàn)象［22］。中藥本身具有多成分，多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì)，可通過有效物質(zhì)成分作用于神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)體內(nèi)各種神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)起到抗抑郁作用。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，海馬區(qū)GABA，5?HT，DA 在LPS注射后2 h 和6 h 比給藥組降低，Glu 和ACh 在LPS 注射后2 h 和6 h 比給藥組升高。但在LPS 注射后12 h 和24 h 與給藥組相比各神經(jīng)遞質(zhì)含量無明顯變化。表明梔子總環(huán)烯醚萜通過與海馬區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)遞質(zhì)的變化，結(jié)合此結(jié)果推測(cè)小鼠在LPS 注射后2 h～6 h內(nèi)總環(huán)烯醚萜有較好的抗抑郁作用，6 h 后總環(huán)烯醚萜無抗抑郁作用。產(chǎn)生此種變化的原因可能是由于梔子總環(huán)烯醚萜在體內(nèi)逐漸代謝，6 h 后藥效逐漸減弱，導(dǎo)致模型組和給藥組沒有差異。

本研究采用LC?MS／MS 法同時(shí)測(cè)定LPS 誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠海馬區(qū)5 種神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化。結(jié)果表明總環(huán)烯醚萜在LPS 注射后2～6 h 具有良好的抗抑郁作用，其作用機(jī)制是通過提升海馬區(qū)GABA、5?HT、DA 水平以及降低Glu，ACh 的水平實(shí)現(xiàn)的。揭示了總環(huán)烯醚萜對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，也為臨床上梔子總環(huán)烯醚萜治療抑郁癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。