SetDB1和P53在結直腸癌組織中的表達及意義＊

文/梁家東，梁麗梅，黃炳臣，吳雪銘，王娟

結直腸癌是目前最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤死亡率中排在第四位[1]。SetDB1（set domain bifurcated 1）是組蛋白甲基轉移酶中重要的結構域之一，在組蛋白的甲基化中扮演了重要的角色。p53屬于抑癌基因，在結直腸癌發生、發展的過程中是由于原癌基因和抑癌基因突變所致的[1]。SetDB1在結直癌中如何通過調控H3K9me3，使p53對原癌基因失去抑癌作用的研究鮮有文獻報道，因此，本文通過免疫組織化學的方式, 研究結直腸癌SetDB1的表達與p53的表達之間的關聯性以及其臨床病理特征，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集右江民族醫學院附屬醫院2017年5月至2019年8月期間病理科診斷明確的原發性結直腸癌患者癌組織及其距癌組織＞ 5 cm處的癌旁組織72例。其中男性49例，女性23例，年齡32-88歲，平均年齡為56.6±3.1歲。

納入條件：（1）所有病例都是經本科室一名副主任病理醫生級別以上診斷明確的結直腸原發性腺癌。（2）所有病例都未經過化療和放療。（3）所有病例都是外科醫生行根治術。（4）所有病例都經患者及其家屬知情或簽署知情同意書。

排除條件：（1）病理醫生診斷為黏液腺癌。（2）雖是根治術，但腸系膜未找到15枚淋巴結以上的病例。（3）未取得患者及其家屬知情或簽署知情同意書的病例。

1.2 試劑材料

SetDB1 鼠抗人抗體購自Abcam公司，P53兔抗人抗體購自上海邁新公司；EDTA抗原修復液和DAB顯色試劑盒均從北京中杉金橋生物技術有限公司購買；SA1022-SABC 試劑盒從武漢博士德生物有限公司購買。

1.3 免疫組化染色SP法

所有標本都經過常規固定、脫水、透明、石蠟包埋、蠟塊進行3um厚連續切片、撈片、烤片處理,置于60℃烤箱中烤片過夜，后經三缸二甲苯溶液及三缸等級濃度梯度的乙醇溶液中脫蠟至水洗，隨后嚴格按照免疫組化SP法說明書的步驟分別對SetDB1蛋白和P53蛋白進行檢測。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色，用自來水沖洗，終止顯色。進行蘇木精復染，分化，返藍 ，脫水，透明，封片后鏡檢。利用PBS 液代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定標準

由本科室兩位主治級別以上病理醫生各自獨立根據細胞染色強度和陽性細胞百分率進行綜合判定。染色強度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分率：陽性細胞率 ≤10%為0分，陽性細胞率 11%～50%為1分 ，陽性細胞率51%～75%為2分 ，陽性細胞率≥76%為3分。兩項評分之積為基因表達情況：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，≥5分為強陽性[2]。

1.5 統計學分析

相關數據運用 SPSS 17.0 統計學軟件進行分析。采用兩兩比較卡方檢驗或等級資料Mann-Whitney 檢驗統計計數資料，采用秩和檢驗分析兩者相關性，P ＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SetDB1蛋白在結直腸癌中的表達及與癌組織浸潤程度、淋巴結轉移的關系

結直腸癌組織中SetDB1蛋白陽性表達率為77.78%，明顯高于癌旁組織SetDB1蛋白陽性表達率 30.56%，差異具有統計學意義（x2＝ 9.051，P ＜ 0.05）。

在72例癌組織中有44例侵及肌全層，SetDB1陽性表達率為86.36%，在28例未侵及肌全層中，SetDB1陽性表達為64.29%，差異顯著（x2=4.826，p＜0.05）；這表明SetDB1的陽性表達可能參與腫瘤的浸潤生物學行為。在50例淋巴結轉移患者中SetDB1的陽性表達率為86.00%，而在22例未發生淋巴結轉移的患者中Set1 DB1的陽性表達率為59.10%，差異顯著（x2＝6.401，P ＜0.05）。這提示Set1 DB1 的陽性表達可能參與腫瘤的轉移生物學行為。

2.2 P53在結直腸癌中的表達及與淋巴結轉移的關系

結直腸癌的癌灶、癌旁組織中P53的陽性表達率分別為59.72%、11.11%，前者明顯高于后者，差異具有統計學意義（x2＝ 6.070，P＜0.05）；50例淋巴結轉移患者中，p53陽性表達率為68.00%，22例淋巴結無轉移患者中，p53陽性表達率為40.91%，差異具有統計學意義（x2＝4.661，P ＜0.05），這提示p53的陽性表達可能參與腫瘤的轉移生物學行為。

2.3 SetDB1與P53相關性分析

癌組織中 SetDB1 與P53 均可呈高表達，且 SetDB1 與 P53陽性表達存在正相關性（OR＝0.515，p＜0.05），見表1。

3 討論

多基因協同作用參與結直腸惡性腫瘤的發生、發展。研究[3]表明，組蛋白尾部能通過甲基化共價修飾來組成組蛋白密碼，進而調節著許多生物學行為。SetDB1是組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶家族中的一員，SetDB1能與異染色質蛋白1及其共抑制子（KAP1）在異染色質中結合，促進H3K9me3的形成，進而參與腫瘤的發生、發展。本研究顯示，SetDB1癌組織中的表達（陽性率77.78%）相對于其癌旁組織的表達（陽性率30.56%）有明顯增高，提示SetDB1有促進腫瘤細胞的生長作用。另外，SetDB1的陽性表達與侵及肌全層及淋巴結轉移有關，陽性率分別為86.36%和86.00%，差異顯著，提示SetDB1的陽性表達可能參與腫瘤的浸潤和轉移生物學行為。但SetDB1表達與腫瘤分化程度無關，這一結果與盧子劍等[4]研究的結果不相符，這可能與標本選擇及數量有關,從而在以后的研究中將進一步增加標本的數量給予實驗證實。

人體中存在原癌基因和抑癌基因，若細胞的基因發生了突變，人的免疫力就會降低。在此基礎上，若再受到其他不利因素的刺激，抑癌基因將失去對組織細胞的抑制作用，使得組織細胞快速生長，最終演變為癌癥。p53基因是一種抑癌基因，具有較高的突變率，目前，已證實在腎癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中存在p53基因突變，且50%以上的原發性腫瘤也與P53突變存在相關性[5]。本研究顯示P53癌組織中的表達（陽性率為59.72%）相對于其癌旁組織的表達（陽性率為11.11%）有明顯增高，提示腫瘤細胞的生長能促進P53的突變。另外，p53在有淋巴結轉移的癌組織中陽性表達為68.00%，差異具有統計學意義，提示P53可能參與腫瘤的轉移生物學行為。同時，在本研究中提示SetDB1和p53在結直腸癌組織中的表達存在中度的正相關性，說明SETDB1的存在能降低P53的抑癌作用。

綜上所述，Set-DB1和P53在結直腸癌組織中的表達存在中度的正相關性，說明SETDB1的存在能降低P53的抑癌作用。但通過降低SetDB1基因的表達是否也降低p53的突變而恢復p53抑制結直癌細胞增殖并促進其凋亡有待進一步研究。