男性乙型肝炎病毒感染對冷凍胚胎移植結局的影響

孫成光

(重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科 重慶 400010)

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種DNA病毒，可在人群中通過血液或者其他體液傳播，引起急性或慢性肝臟損傷。據世界衛生組織統計，全球約有2.57億人患有慢性乙肝感染[1]。我國是乙型肝炎病毒感染大國，2013年至2017年，我國普通人群HBV感染患病率為6.89%（95%Cl:5.84%-7.95%），據此推斷，2018年我國約有8400萬人乙型肝炎病毒表面抗體（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性[2]。

HBV主要傳播途徑有母嬰傳播、密切生活接觸傳播、性傳播等。當皮膚黏膜受損時，接觸到HBV攜帶者的血液、唾液、精液、陰道分泌物等就會造成病毒的傳播感染[3][4]。近年，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）技術應用越來越廣泛，我國每年人類輔助生殖技術類別總周期數超100萬，出生嬰兒數超過30萬3，而我國HBV高風險地區育齡期男性HBV感染率為6.35-6.47%4，HBV感染對輔助生殖技術的影響近些年也受到關注。研究發現，男性感染HBV會導致精液質量下降，引起男性不育[5][6][7]。同時，HBV的DNA會整合到胚胎基因組中進行表達，造成胚胎攜帶有HBV，對胚胎的發育造成潛在的影響[8][9][10]。然而，對于男性感染HBV對冷凍胚胎移植（Frozen embryo transfer，FET）結局的影響國內外研究較少。

在IVF-ET過程中因各種原因無法移植新鮮胚胎而需將胚胎進行冷凍保存，隨后擇期行FET。目前，冷凍胚胎主要使用玻璃化冷凍技術，胚胎的冷凍、解凍的效率和安全性得到了有效保障。HBV整合到胚胎基因組后會持續表達產生新的蛋白，這些蛋白可能對胚胎著床、發育等造成潛在影響。本文回顧分析男性感染HBV患者FET周期的臨床結局及其相關影響。

一、對象與方法

（一）研究對象

在2016年1月至2020年3月于重慶醫科大學附屬第二醫院生殖中心行第一次FET輔助生殖助孕患者中進行篩選。其中男方血清HBsAg陽性，且女方血清HBsAg陰性為HBV感染組，男女雙方血清HBsAg均為陰性的為對照組。排除標準為：移植第3天胚胎細胞數小于7或胚胎級別為三級；移植囊胚級別為3BB或4BC以下；女方存在反復著床失敗、復發性流產、控制不良的內分泌疾病、宮腔疾病、子宮內膜異位癥；男女雙方存在丙型肝炎（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染等。

（二）治療方案

1.胚胎冷凍與解凍

在IVF-ET周期中，培養至卵裂期胚胎或囊胚期胚胎，若沒有移植，可考慮將可利用胚胎進行冷凍保存。根據伊斯坦布爾共識[11]卵裂期優質胚胎定義為：細胞數為7-12個，細胞大小與發育階段相符，無多核現象，碎片率＜10%。囊胚的優質胚胎定義為：囊胚發育階段至少為3-4期；內細胞團形態規則，直徑60μm以上，細胞大小均勻，融合；滋養細胞層沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球數明顯超過10個，大小均勻，在囊胚底面的細胞全部形態清晰，大多數可見細胞核。胚胎玻璃化冷凍載體（CRYO BIO SYSTEM-TMV Technologies公司，法國）和玻璃化冷凍試劑（Vitrification Kit，SAGE公司，美國）進行玻璃化冷凍保存。FET周期的胚胎解凍采用解凍試劑盒（Wanning Kit，SAGE公司，美國）進行胚胎解凍。

2.FET

FET周期內膜準備方案分為自然周期和人工周期兩種。對于月經規律，既往內膜情況良好的患者可采用自然周期行FET，自然周期于排卵日當日開始口服孕酮（地屈孕酮，abbott公司，荷蘭）轉換內膜。對于既往月經不規律或內膜情況較差以及有內膜異位、子宮肌瘤等患者，可考慮行人工周期行FET，人工周期一般采用雌孕激素序貫方式建立，轉換內膜時間和方式與自然周期相同。卵裂期胚胎一般在內膜轉換的第4天移植，囊胚則一般在內膜轉換的第5天移植。每個FET周期最多移植2枚胚胎。

（三）隨訪觀察指標

以臨床妊娠情況作為主要觀察指標，以胚胎移植后28-35天，彩超下可見宮內孕囊、胎心、胚芽為準，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總移植周期數*100%。次要指標為胚胎著床率、生化妊娠率和早期流產率。血清人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）≥25IU/L為生化妊娠，生化妊娠率=生化妊娠周期數/總移植周期數*100%。妊娠小于13周流產稱為早期流產，早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數*100%。

（四）統計學方法

采用SPSS 26軟件進行數據統計分析。定量資料首先采用Shapiro-Wilk檢驗進行數據正態性檢驗，若符合正態分布組間比較采用t檢驗；若不符合正態分布則組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。定性資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。單因素Logistic回歸分析妊娠相關因素，多因素Logistic回歸分析各因素相關性。所有檢驗均以P＜0.05為差異有統計學意義。

二、結果

（一）HBV感染組與對照組基線資料對比

感染組與對照組共計納入個770個FET周期，其中HBV感染組108個周期，對照組662個周期。兩組患者在年齡（女方）、BIM（女方）、繼發不孕比例、不孕原因、IVF周期獲卵數、全胚冷凍比例、FET周期內膜準備情況、胚胎解凍存活情況、移植胚胎情況等數據對比，均無統計學差異（P＞0.05）見表1。

表1 兩組研究對象的基線特征

注：*采用Fisher確切概率法

（二）FET周期結局

兩組患者在臨床妊娠率、胚胎種植率等方面差異無統計學意義（P＞0.05），而在活產率及早期流產率方面兩組患者差異有統計學意義（P＜0.05）詳見表2。

表2 FET妊娠情況

（三）單因素Logistic回歸分析

將所有可能對妊娠結局造成影響的參數進行單因素Logistic回歸分析，發現各因素與臨床妊娠結局Logistic轉換存在線性關系，詳見表3。從中選擇HBV感染、女方年齡、繼發不孕、卵巢因素、移植優質胚胎等因素進行多元Logistic回歸分析，詳見表4。

表4 多元Logistic回歸分析結果

表3 單因素Logistic回歸分析

三、討論

本文通過回顧性分析FET周期中男性HBsAg攜帶的患者與健康對照組之間的臨床數據對比分析，探討男性HBsAg攜帶對FET周期妊娠結局的影響。研究結果顯示，男性HBV感染對于胚胎的解凍存活、胚胎種植、臨床妊娠率等無影響，但HBV組在活產率（28.7%vs41.1% P=0.015）和早期流產率（27.9%vs13.1%P=0.010）差異有統計學意義，表明HBV感染會增加早期妊娠的流產率，降低活產率。多元Logistic回歸結果顯示女方年齡（OR=0.932，95%CI=0.891-0.980，P=0.005）和移植優質胚胎（OR=0.671，95%CI=0.457-0.985，P=0.042）對臨床妊娠結局有較大影響，而HBV感染對于臨床妊娠率無明顯影響。

Hu等[12]對女方、男方或男女雙方均為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清反應陽性的夫婦的卵母細胞及胚胎進行通過熒光原位雜交檢測發現卵母細胞及胚胎細胞中均發現HBVDNA。同時Ye[13]等在女方HBV攜帶的胚胎中檢測出HBV mRNA,顯示HBV存在轉錄、表達以及產生蛋白質等，這些都可能對胚胎造成影響。葉峰等[14]通過對慢性HBV感染父親體外受精后遺棄胚胎進行單細胞RT-PCR發現胚胎中檢測出HBVmRNA。同時其研究顯示，父親攜帶有HBV感染的胚胎移植后臨床妊娠率無明顯差異，檢測出有HBVmRNA攜帶的1例同期移植的新鮮胚胎發生了早期流產。本研究顯示，男方有HBV感染FET周期胚胎在解凍移植后胚胎種植率（32.7%vs34.2% P=0.701）、臨床妊娠率（39.8%vs48.5% P=0.094）無明顯差異，但早期流產率（27.9%vs13.1% P=0.010）升高明顯，活產率明顯下降（28.7%vs41.1% P=0.015）。

目前大量研究顯示女性感染HBV會輔助生殖結局造成影響，如對于男性HBV感染對FET周期臨床結局影響的報道非常少，He F等[15]2018年首次報道了FET周期中男性感染HBV對臨床妊娠結局的影響。該文章納入HBV感染周期39個，陰性周期78個，其結果顯示HBV感染會降低臨床妊娠率、胚胎種植率及活產率，本研究結果與其具有一致性。但其流產率兩組比較無明顯差異與本研究相左。分析原因如下：均系回歸性研究，樣本納入存在一定偏倚；男性感染HBV導致胚胎攜帶有HBV的感染效率不是很明確；本次研究是在此基礎之上進行的數據收集可能會導致結果差異；需要更多的前瞻性研究進行驗證。

本研究系回顧性研究，相對存在一些缺陷：樣本納入以本單位收治的病人為來源，缺乏多中心樣本；缺乏對FET胚胎的HBVDNA檢測數據，后續可考慮從FET培養液進行檢測；在樣本量擴大的前提下可制定更加嚴格的納入標準，如增加卵巢功能評估、促排卵方案的評估、不良生活習慣及心理狀態評估等；后續研究可考慮進行前瞻性研究，進一步評價男性HBsAg攜帶對胚胎冷凍及胚胎發育的影響。